以質(zhì)粒或噬菌體作載體進(jìn)行DNA克隆,，在理論上是很簡捷的,，即用一種限制酶切割質(zhì)粒DNA，然后在體外與外源,，DNA(如干擾素基因,，生長激素基因)相連接，再用所得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌如大腸桿菌,，以鑒定重組DNA,。

　　通常所用的質(zhì)粒載體有pBR322、pUC18,、pUC19等,，噬菌載體有M13噬菌體載體等。

　　一,、質(zhì)?；蚴删w載體與外源DNA的連接反應(yīng)

　　外源DNA片段末端的性質(zhì)，以及質(zhì)粒載體和外源DNA上限制酶切位點(diǎn)的性質(zhì)決定了質(zhì)?；蚴删w與外源DNA連接反應(yīng)的不同策略,。

　　(一)外源DNA帶有非互補(bǔ)突出端的片段

　　用兩種不同的限制酶分別消化質(zhì)粒等載體和外源DNA，可以產(chǎn)生帶非互補(bǔ)突出端的片段,，這是最容易連接的片段,，如圖24-1所示,。

　　將已經(jīng)連接外源DNA的細(xì)菌質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌，然后在含有AP等抗生素的平板上鑒定陽性重組體菌落,，具體方法有：①檢查α互補(bǔ)能力的喪失情況;②對小量制備的質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切的分析;③核酸雜交,。

　　(二)外源DNA帶有相同末端(平端或粘端)的片段

　　帶有相同末端(平端或粘端)的外源DNA片段必須克隆到具有匹配末端的線狀質(zhì)粒或噬菌體載體中,，在連接反應(yīng)中,，質(zhì)粒或噬菌體載體可能發(fā)生自身環(huán)化,，也可能形成串聯(lián)寡聚物,。因而，常常使用堿性磷酸酶去除5’磷酸基團(tuán)以抑制質(zhì)粒DNA的自身連接和環(huán)化,。用細(xì)菌堿性磷酸酶(BAP)或牛小腸堿性磷酸酶(CIP)去除線狀DNA兩端的5’磷酸可以最大限度地減少質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化,。而具有5’末端磷酸的外源DNA片段可有效地與去磷酸化質(zhì)粒DNA相連接，產(chǎn)生一個(gè)含有兩個(gè)切口的開環(huán)分子,。因?yàn)榄h(huán)化DNA(即使只帶切口的環(huán)狀DNA)的轉(zhuǎn)化效率比線狀DNA高得多,，所以大多數(shù)轉(zhuǎn)化體都含有重組質(zhì)粒，如圖24-2所示,。

　　圖24-2 利用磷酸酶防止載體DNA的重新環(huán)化

　　(三)外源DNA帶有平端的片段

　　外源DNA片段帶有平端的片段,，平端的連接效率比帶有互補(bǔ)末端的DNA要低得多。因此,，涉及平端分子的連接反應(yīng)所要求的T4噬菌體DNA連接酶的濃度和外源及質(zhì)粒DNA或噬菌體DNA的濃度都要高得多,。

　　(四)連接反應(yīng)的體系

　　10×連接緩沖液1μl

　　10mMATp 1μl

　　質(zhì)粒或噬菌體DNa200ng～1μg

　　外源DNa 200ng～1μg

　　T4噬菌DNA連接酶0.5～2nuits

　　4-6℃溫育8～24h

　　連接反應(yīng)結(jié)束時(shí),，取1～5μl上述反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化200μl的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞,，即可將外源DNA與載體接連起來。

　　二,、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化

　　細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法多以Mendel和Higa(1970)的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ),，其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化,。

　　用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌,。本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株,，且迅速、重復(fù)性好,。操作過程簡述如下,。

　　1.從37℃培養(yǎng)16～20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落(如大腸桿菌DH52)，或1ml新鮮的16～20h過夜培養(yǎng)物,，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中,。于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2～3h(旋轉(zhuǎn)搖床200～300r/min),，每隔20～30min測量OD600值≈0.4。

　　2.在無菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè),，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中,，在冰上放置10～20min。

　　3.于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭(或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,，以回收細(xì)胞,。

　　4.倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,。

　　5.以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀,，放于冰上。

　　6.于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭(或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭)以4000r/min離心10min,，以回收細(xì)胞,。

　　7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡,。

　　8.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1M CaCl2重懸每份沉定,，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份,，液氮中冰凍,，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

　　9.用冷卻的無菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物(體積≤10μl,，DNA≤50ng),，輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min,。

　　10.將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上,，放置90s～2min，不要搖動試管,。

　　11.快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中,，使細(xì)胞冷卻1～2min。

　　12.每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基,，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃,，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇,，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因,。

　　13.將適當(dāng)體積(每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl)已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/l MgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上。

　　14.將平板置于室溫至液體被吸收,。

　　15.倒置平皿,，于37℃培養(yǎng)，12～16h后可出現(xiàn)菌落,。

　　三,、用M13噬菌體轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞

　　1.感受態(tài)細(xì)胞的制備

　　(1)用JM101或TG1等菌的培養(yǎng)菌液在M9基本培養(yǎng)基平板上的劃線培養(yǎng),，于37℃溫育24～36h。

　　(2)批量制備凍存的感受態(tài)細(xì)胞的方法,，同大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備,。

　　2.用M13噬菌體轉(zhuǎn)染感受態(tài)細(xì)胞

　　(1)用2×YT或SOB培養(yǎng)液于37℃持續(xù)地振搖，將用于鋪平板的細(xì)胞(JM101或TG1等)培養(yǎng)過夜,。

　　(2)從-70℃以下冰箱中取出一份凍存的JM101或TGI感受態(tài)細(xì)菌,，于室溫慢慢融化，立即放在冰上10min,。

　　(3)于各感受態(tài)細(xì)胞管中,，加入連接反應(yīng)液，應(yīng)同時(shí)做兩個(gè)對照,，一個(gè)加5pgM13噬菌體雙鏈環(huán)狀DNA,，另一個(gè)則完全沒有DNA。輕彈管外壁使其混勻,，冰浴30min,。

　　(4)取數(shù)支無菌培養(yǎng)管，分別加入3ml熔化的2×YT或SOB頂層瓊脂,，置47℃以備步驟6使用,。

　　(5)將裝有感受態(tài)細(xì)胞和DNA的培養(yǎng)管放入42℃水浴，溫育整整90s,，立即將管放回冰浴之中,，2min后各管加入1ml過夜培養(yǎng)的JM101或TG1等菌液，混勻,。

　　(6)在步驟(4)準(zhǔn)備的裝有溶化的2×YT或SOB頂層瓊脂的管內(nèi)各加入40μlX-gal溶液(20mg/ml,，溶于二甲基甲酰胺)和4μlIPTG溶液(200mg/ml)振蕩混勻，分別取(5)中混合物各300μl加入各管,，振蕩混勻,，立即將管內(nèi)混合物傾入標(biāo)記好的LB瓊脂平板上，輕輕旋動平皿,，以使細(xì)菌與頂層瓊脂分布均勻,。

　　(7)蓋好平皿，于室溫放置5min,，使頂層瓊脂凝固,，將平板倒置于37℃培養(yǎng)。4個(gè)h后噬斑開始出現(xiàn),，8～12h后菌斑不再變化。野生型M13噬菌體形成的噬斑為深藍(lán)色,，重組噬菌體則可形成無色噬斑,。

　　四,、含重組質(zhì)粒的細(xì)胞菌落的鑒定

　　含重組質(zhì)粒的細(xì)胞菌落常用的鑒定方法有：①小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制酶切分析;②α互補(bǔ);③插入失活;④雜交篩選。下面簡要介紹小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行限制性酶切分析,。小規(guī)模制備質(zhì)粒DNA可用天美等公司的Wizard Minipreps DNA試劑盒或采用下述方法：

　　1.挑取一些獨(dú)立的轉(zhuǎn)化菌落進(jìn)行小規(guī)模培養(yǎng),，用無菌牙簽或挑種環(huán)挑取單菌落于2ml含有相應(yīng)抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，于37℃劇烈振搖下培養(yǎng)過夜,。

　　2.將1.5ml培養(yǎng)物倒入微量離心管中,，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心30s，將剩余的培養(yǎng)物貯存于4℃,。

　　3.吸取培養(yǎng)液,，使細(xì)菌沉淀盡可能干燥。

　　4.將細(xì)菌沉淀重懸于200μl溶液Ⅰ中,，劇烈振蕩,。

　　溶液Ⅰ 25mmol/L Tris·HCl(pH8.0)

　　10mmol/LEDTA(pH8.0)

　　溶液Ⅰ可成批配制，每瓶約100ml,，高壓下101bf/m2(6.895×104pa)蒸氣滅菌15min,，貯存于4℃。

　　5.加200μl新配制的溶液Ⅱ,。

　　溶液Ⅱ 0.2mol/L NaOH

　　1% SDS

　　蓋緊管口,，快速顛倒離心管5次，以混合內(nèi)容物,。應(yīng)確保離心管的整個(gè)表面均與溶液Ⅱ接觸,。不要振蕩，將離心管放置于冰上,。

　　6.加200μl溶液Ⅲ

　　溶液Ⅲ 5mol/l 乙酸甲 60ml

　　冰乙酸11.5ml

　　水28.5ml

　　蓋緊管口,，將管倒置，溫和振蕩10min,，使溶液Ⅲ在粘稠的細(xì)菌裂解物中分散均勻,，之后將管置于冰上3～5min。

　　7.用微量離心管于4℃以12000g離心5min,，將上清轉(zhuǎn)移另一離心管中,。

　　8.加等量酚和氯仿，振蕩混勻,，用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心2min,，將上清轉(zhuǎn)移到另一離心管中。

　　9.用2倍體積的乙醇于室溫沉淀雙鏈DNA,，振蕩混合,，于室溫放置2min。

　　10.用微量離心機(jī)于4℃以12000g離心5min。

　　11.小心吸去上清液,，將離管倒置于一張紙巾上,，以使所有液體流出。再將附于管壁的液滴除盡,。

　　12.用1ml70%乙醇于4℃洗滌雙鏈DNA沉淀,，按步驟1所述方法去掉上清，在空氣中使核酸沉淀,，干燥10min,。

　　13.用50μl含無DNA酶的胰RNA酶(20μl/ml)的TE重新溶解核酸，振蕩,，貯存于-20℃,。

　　14.用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶分析所得DNA。

　　五,、M13噬菌體重組DNA分子導(dǎo)入大腸桿菌

　　1.感受態(tài)細(xì)胞的制備

　　(1)將1ml過夜培養(yǎng)的細(xì)菌(如DH52,、TG1、TM101)接種于100ml2×YT培養(yǎng)于500ml燒瓶,。于37℃刷烈振蕩,，通常≥200rpm培養(yǎng)的細(xì)菌密度約OD550=0.2～0.5(5×107cells/ml),需2～4h,。

　　(2)將培養(yǎng)物放于冰上致冷10min,，于4℃離心細(xì)菌培養(yǎng)物，10000rpm離心10min,。

　　(3)棄除上清,，將細(xì)菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半(約50ml)的50mMCaCl2和10mmTris·HCl(pH8.0)無菌冷凍液體中。

　　(4)將細(xì)菌懸浮放在冰上約5min,，然后將懸浮物于4℃10000/rpm離心10min,。

　　(5)棄上清，懸浮細(xì)菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl(pH8.0)無菌冷凍中,。此時(shí)的細(xì)胞是感受態(tài)細(xì)胞,，即可用于轉(zhuǎn)化。200μl分裝于無菌的1.5ml微量離心管中,，貯存于-80℃冰箱中,。

　　2.轉(zhuǎn)化程序

　　(1)取出200μl感受態(tài)細(xì)胞慢慢使其溶化，并立即放于冰上,，加入DNA或連接反應(yīng)混合物,，DNA量通常≤50mg,。用手指彈打試管10次,，使之混勻,，然后放在冰上40～45min。

　　(2)將管放于42℃水浴中2min,。

　　(3)然后每管直接加入1.0ml2×YT培養(yǎng)基,，倒置混勻，并于37℃培養(yǎng)8～12h,，干浴或水浴，不需振搖,。此期間使細(xì)菌生長并開始表達(dá)抗菌素,。

　　(4)每200μl轉(zhuǎn)化混合物分別于6個(gè)2×YT瓊脂培養(yǎng)板上補(bǔ)充相應(yīng)抗生素，并含有X-gal(20mg/ml),、IPTG(200mg/ml),。

　　(5)鋪板使細(xì)菌混合物干后，倒轉(zhuǎn)平板放于30～37℃培養(yǎng)箱中18～22h,?？寺≡诖似陂g應(yīng)該出現(xiàn)，否則轉(zhuǎn)化不成功,。