1.目的基因的設(shè)計

　　在進行轉(zhuǎn)基因動物研究時,，首先要針對實驗?zāi)康脑O(shè)計待轉(zhuǎn)移的目的基因,，如隨機整合型基因或基因敲除(gene knockout)型載體基因。隨機整合型基因可來自于同一基因,，也可來自于不同基因(拼接基因),。從結(jié)構(gòu)上看，隨機整合型基因可分為結(jié)構(gòu)基因與調(diào)控序列兩部分,。若來自于同一個基因,，那么該基因必須完整，包括5'上游啟動子區(qū)和3'下游的加尾信號(polyA signal)區(qū)等,，可從基因組文庫中分離完整的基因,。拼接基因應(yīng)用更為廣泛，可通過選擇不同的啟動子來控制外源基因表達的組織特異性,。進行基因剔除轉(zhuǎn)基因動物研究時,，首先要設(shè)計與待剔除基因的同源性的載體基因，包括正負選擇標志基因,，通過同源重組(同源取代或同源插入)而使目的基因失活,，從而建立缺基因動物。在進行基因設(shè)計時,，還應(yīng)考慮轉(zhuǎn)基因動物的遺傳背景和設(shè)計相應(yīng)的檢測方法,，必要時設(shè)計一個報道基因(reporter gene)。

　　2.載體的選擇

　　運用轉(zhuǎn)基因動物研究基因表達,，特別是在研究遺傳性疾病和進行基因治療時,，選擇合適的基因載體是十分必要的。載體主要用于未克隆基因的擴增和選擇,，有關(guān)實驗表明,，載體有DNA序列可以干擾外源基因的表達，其原因可能與DNA的甲基化有關(guān),。最早用于哺乳類細胞表達載體的病毒是轉(zhuǎn)化型DNA病毒,，如SV40和腺病毒,。這些載體的主要缺點是接受外源DNA容量太小,，只能攜帶約7～8kb的外源序列，因此這類載體不可能表達其他許多與疾病有關(guān)的功能基因,。與其他載體相比,，從鳥類和鼠類中獲得的逆轉(zhuǎn)錄病毒是目前應(yīng)用廣泛的一類最有前途的載體,。這類病毒為失去致病能力但仍有感染能力的缺陷病毒，如通常使用的禽白血病病毒和羅氏肉瘤病毒,。這類病毒載體能有效地把外源基因?qū)氩溉閯游锇屑毎?，其整合方式在結(jié)構(gòu)和功能上較穩(wěn)定，功能基因插入和表達很容易。為避免逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動子干擾和攜入誘變的可能性,，許多研究者還構(gòu)建出一類已被剪除了自身啟動子和增強子序列的逆轉(zhuǎn)錄病毒,。這類失活載體只表達由基因攜帶的啟動子起始的載體編碼序列，但這種載體因其滴度低而使應(yīng)用受到限制,。近來有報道指出,，利用帶有部分缺失失活的新霉素抗性基因(neor)的缺陷型整合逆轉(zhuǎn)錄病毒載體感染大鼠細胞，使整合到細胞中的neor缺陷基因功能得到恢復(fù),。非整合型病毒載體,，如HSV載體已引起人們極大關(guān)注，這類病毒基因組較大(150kb),，它們具有比其他已知載體接受更大外源序列的能力,，故能夠轉(zhuǎn)移和表達較大的基因。

　　3.背景及種系的選擇

　　由于不同種系的動物對不同疾病的易感性不同,，在進行轉(zhuǎn)基因動物研究時要考慮遺傳背景及種系的問題,。許多實驗室在隨機雜交背景下建立了轉(zhuǎn)基因動物，同近親交配的轉(zhuǎn)基因動物相比,，這一背景下產(chǎn)生的胚胎不但數(shù)量多,，而且健康。盡管如此,，隨機交配下的堿基分離可能影響轉(zhuǎn)基因動物的表型,，降低了一個已知轉(zhuǎn)基因動物的作用。在混合遺傳背景下,，堿基分離也直接影響基因動物的表達,。已發(fā)現(xiàn)一種能夠直接抑制了轉(zhuǎn)基因的表達的種系特異性修飾因子(SSM-1)。在C57BL/6J鼠系中,，SSM-1堿基分離直接抑制了轉(zhuǎn)基因的表達,。相反，在DBA/2JSSM-1鼠中可交配的DBA/2J小鼠,，可以消除SSM-1堿基分離產(chǎn)生變異的轉(zhuǎn)基因表達,。

　　迄今為止，已相繼報道了小鼠,、大鼠、兔,、豬,、牛和羊等轉(zhuǎn)基因的動物。目前,，研究者均傾向于使用小鼠作轉(zhuǎn)基因的動物,。最初的轉(zhuǎn)基因動物就是在小鼠體內(nèi)完成的，已確定了小鼠的連鎖圖。盡管由于小鼠與人脂蛋白系統(tǒng)有很大差異,，如小鼠缺乏膽固醇酯轉(zhuǎn)移蛋白(CETP),、載脂蛋白(a)[Apo(a)]和脂蛋白(a)[Lp(a)]，其多數(shù)膽固醇通過HDL而不像人那樣通過LDL進行運輸,，但由于小鼠易于飼養(yǎng)管理,，生長周期短，容易獲得已經(jīng)定性的近交交配鼠和遺傳突變體,，并且易于進行快速連鎖分析,，其作為研究動物也較為經(jīng)濟實惠，故常被用作建立轉(zhuǎn)基因動物模型,。但小鼠對AS具有抗性,，為使小鼠產(chǎn)生AS，必需喂養(yǎng)非生理性食物,，包括1.25%的膽固醇(為人類飲食的10～20倍),，15%的脂肪和0.5%的膽酸(非正常食物組分)。嚴格地講,，這種飼料是具有毒性的,，但可使小鼠的非高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)增至200～300mg/ml，4～5個月即可形成AS,。

　　4.轉(zhuǎn)基因方法

　　進行轉(zhuǎn)基因動物研究的基因轉(zhuǎn)移方法有多種,，如早期的畸胎癌細胞(teratocarcinoma cell,TCC)植入法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法,、顯微鏡注射法以及近幾年新出現(xiàn)的方法如電轉(zhuǎn)移法,，精子載體法，胚胎干細胞(embryonal sterm cell,ES細胞)法,、基因直接導(dǎo)入法等,。其中較常用的三種方法有顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法和胚胎干細胞法(見圖23-1),。

　　圖23-1 三種常用的轉(zhuǎn)基因方法

　　顯微注射法是直接將重組DNA分子以微注射的方式導(dǎo)入單細胞卵的原核中,，再將它植入假孕母鼠。大約20%的微注射胚胎能夠?qū)⑼庠椿蛘系饺旧w基因上組上;大多數(shù)的轉(zhuǎn)基因的動物能夠?qū)⒄系幕騻鹘o后代,，建立起轉(zhuǎn)基因鼠系,。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法是用高滴度的、攜帶外源基因的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒感染發(fā)育早期的胚胎,，再將感染病毒后的胚胎植入假孕母鼠,，以產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因的動物。逆轉(zhuǎn)錄病毒的整合并不影響宿主DNA序列的重排,，感染的復(fù)數(shù)容易調(diào)整,，每個卵大約有10次整合的機會,。病毒染色體還能提供一個TAG分子，加速覆蓋部位的迅速克隆,。這些特征使逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)基因法用于研究隨機突變,。從ES細胞到轉(zhuǎn)基因動物是從哺乳動物胚胎中分離出ES細胞，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)或傳染的方法,，將外源基因轉(zhuǎn)入ES細胞,，再以微注射的方式將其植入鼠的胚胎。這種方法能夠?qū)⑼庠椿蚨ㄎ粚?dǎo)入靶細胞染色體上某一特定部位,，或使某一基因發(fā)生定點突變,。

　　上述三種方法各具有優(yōu)缺點。顯微注射法相對整合率較高(1%～10%),，操作簡便,，易于獲得成功。但外源基因通常以多拷貝串聯(lián)的形式隨機整合于受體基因組中,，這種異常排列可能妨礙其表達的正常調(diào)節(jié),。逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法的外源基因通常是單位點、單一拷貝整合,，整合通常發(fā)生在逆轉(zhuǎn)錄病毒的長末端重復(fù)區(qū)(LTR),，從而保證了外源基因結(jié)構(gòu)的完整性。但整合效率較低,，而且操作比較繁瑣,，能被導(dǎo)入的基因大小有一定限制(通常為10kb左右)。ES細胞法多只能建立嵌合體動物,，如果注射有外源基因的ES細胞在胚胎內(nèi)的發(fā)育過程中嵌合到生殖腺,，則所建立的嵌合體動物不能把外源性基因傳給后代。但通過ES細胞法可以進行基因打靶(gene targeting)或基因剔除產(chǎn)生缺基因動物,，這是目前建立某些疾病動物模型的一種新的有效途徑,。

　　5.轉(zhuǎn)基因動物模型的建立

　　新出生的轉(zhuǎn)基因動物通過點雜交、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和免疫印跡雜交(Southern Northern blotting)等方法,，先篩選出有外源基因整合的陽性動物,，傳代后分別在mRNA和蛋白水平上檢測外源基因在轉(zhuǎn)基因動物中的表達情況，對外源基因表達產(chǎn)物的生物活性和生化性質(zhì)進行鑒定,，以及檢查轉(zhuǎn)基因動物的生理功能和是否出現(xiàn)某些疾病病癥狀的表型等,。進一步培育和篩選出轉(zhuǎn)基因動物的純合子，或/和某些相關(guān)種系的動物雜交,，從而建立某種疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型,。

　　利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育人類疾病動物模型比用其他方法更加優(yōu)越，它可在動物原來遺傳背景的基因上,，通過改變某種基因的表達水平而實現(xiàn)。這種模型模擬動物癥狀單一，接近于病人癥狀,，產(chǎn)生這些疾病癥狀的原因是外源基因的轉(zhuǎn)入,。轉(zhuǎn)基因動物模型可按照人們的愿望進行設(shè)計和培育，其建立過程的本身就可進行疾病機理的研究,。由于轉(zhuǎn)基因動物的發(fā)育過程中又引入了時間和空間的因素,，這樣就建立了一個立體的實驗動物體系，不但能從動物整體水平的組織器官水平上進行研究,，而且還可以深入到細胞水平和分子水平,，為發(fā)病機理、藥物篩選和臨床醫(yī)學(xué)研究提供了比較理想的實驗動物體系,。自從1980年第一個轉(zhuǎn)基因動物問世以來,，經(jīng)過科學(xué)家們的不懈努力，已相繼建立了高脂血癥(HLP),、AS,、高血壓、低血壓等心血管疾病的轉(zhuǎn)基因動物模型,。其中應(yīng)用最廣的是各種轉(zhuǎn)基因小鼠(TGM)模型,。