WetterauJ.R等于1984年發(fā)現(xiàn)肝細胞微粒體的離子強度緩沖液里有加速甘油三酯和膽固醇酯轉運作用,，用Bio-Gel A-5m和Hydroxylapatite純化,，并監(jiān)測其活性，發(fā)現(xiàn)該蛋白的激活作用促進甘油三酯轉運的活力大,。經(jīng)凝膠過濾測得分子量約為150kD,，部分純化產(chǎn)品等電點為pH5.2～5.6，該蛋白即為微粒體甘油三酯轉移蛋白(microsmal triglyceridetransfer protein, MTTP),。

　　一,、MTP蛋白質結構及特性

　　1991年，Wetteran J R等發(fā)現(xiàn)MTR由58kD和88kD的兩種亞基組成的異二聚體復合物,。這一特點使之與以前報道的脂質轉運蛋白加以區(qū)別,，以前報道的脂質轉運蛋白是單一多肽，分子量從8kD到53kD不等,，發(fā)現(xiàn)幾種哺乳動物包括人的血漿中的膽固醇酯轉運蛋白(CETP),，均屬于糖蛋白，分子量為74kD,，含一個53kD的多肽骨架,。

　　MTP的58kD的小亞基通過氨基酸分析和免疫化學分析表明他是蛋白二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase,PDI;EC5.3.4.1)早在1963年就在肝和胰腺組織中發(fā)現(xiàn)此酶，其功能之一是催化蛋白質生物合成中的二硫鍵形成,，具有較寬的底物特異性,。PDI在新鮮制備的鼠肝微粒體中未能檢測其活性，但破膜后,，可檢測到二硫鍵異構酶活性,。PDI是一種多功能蛋白，據(jù)報道他又是脯氨酰-4-羥化酶(prolyl 4-hydroxylase)的β亞單位;還與寡糖基轉移酶的糖化位點結合蛋白亞組分高度相似,。PDI羧基端序列Lys-Asp-Glu-Leu與內(nèi)質網(wǎng)上相應受體結合,，使之與88kD組分一起保留在內(nèi)質網(wǎng)腔內(nèi)，PDI基因定位在17號染色體,。據(jù)估計,，牛肝內(nèi)質網(wǎng)腔中游離PDI濃度超過MTP中PDI濃度的五倍。此,，PDI自我組裝成二聚體和四聚體,。MTP中PDI的二硫鍵異構酶活性僅是自由PDI的十分之一。

　　用沉降平衡實驗表明,，這種150kD的MTP有三種不同的沉降速率,。他們分別是MTP、PDI和一個88kD的亞基,。進一步用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,，考馬斯亮藍染色測定一定量MTP中PDI含量,，與標準PDI比較，表明PDI：88kD亞基之比為1：0.98～1.30,，證明MTP中58kD的PDI和88kD亞基化學計量為1：1,。通過超速離心發(fā)現(xiàn)沉降系數(shù)為5.85,Stoke半徑為4.7μm。用鹽酸胍變性實驗表明,，MTP可抵抗0.8M鹽酸胍的變性作用,，PDI與88kD亞基結合穩(wěn)定。PDI與MTP大亞基作用不可逆,，到目前為止,，試圖用其組分或外源PDI重建MTP復合體還未功能。通過遠紫外圓二色光譜分析表明,，MTP約有28%α螺旋和隨機結構(分別為31%和34%),，而88kD亞基的β折疊占35%。

　　MTP的大亞基與已發(fā)現(xiàn)的蛋白相比未發(fā)現(xiàn)高度同源性,。Shoulders等從MTP辨認出幾個區(qū)域與卵黃磷脂蛋白的序列有低水平同源性,。卵黃磷脂蛋白是產(chǎn)卵動物中脂蛋白復合體的蛋白質組分，由卵黃生成素裂解而成,?；诎被嵝蛄小⒎肿幽Ｐ秃突蚪Y構的比較,，認為MTP大亞單位是卵黃生成素基因家族成員之一,。

　　二、MTP基因結構

　　1993年Sharp D.等克隆MTP 88kD大亞基的cDNA并進行序列分析,，比較人和牛的cDNA表明有88%核苷酸序列相同,，在人MTP大亞基的3'末端有基因組DNA編碼的18個腺苷酸殘基，預測的分子量97kDa,，人和牛MTP大亞基單位氨基酸有86%同源性,，加上保守性氨基酸替換，人與牛MTP大亞基單位有94%同源性,。在核苷酸和蛋白序列數(shù)據(jù)庫中未發(fā)現(xiàn)其他蛋白與之同源,。

　　SharpD.等MTP88kD大亞基基因結構進行分析(圖7-7)。其基因跨越55～60Kb,，由18個外顯子組成,，外顯子1和18也分別包括5'和3'的非編碼序列。除掉含非編碼序列的外顯子1和18,，平均每個編碼外顯子的長度是153bp,。

　　圖7-7 人MTP大亞基的基因結構

　　上線表明基因跨度;第二線為MTP大亞基的18個外顯子

　　示意圖;第三四線分別是EcoRI(R)和Hind(H)的酶切位點。

　　SharpD等早期報道,，人MTp cDNA 5'端非編碼區(qū)有64個核苷酸,。用錨定PCR檢測MTpcDNA的5'末端,，從兩個獨立PCR產(chǎn)物的直接序列分析揭示，從翻譯起始的上游有86bp的非編碼序列(見圖7-8),。所有86bp5'端非翻譯區(qū)均編碼外顯子1,，外顯子1還有61bp編碼信號肽及成熟蛋白2個氨基酸。在翻譯起始框外上游25bp有一個ATG,，但該處沒有適合的起始環(huán)境，第二個ATG是真正的翻譯起始點,。

　　圖7-8 MTP大亞基的5'側翼序列

　　轉錄起始點5'側翼序列不含TATA盒,，但富含AT序列，在轉錄起始點上游約30bp的AAAGATAAA可能被TATA結合蛋白(TFⅡD)識別,。用Nothern blot雜交及分析MTP活性表明MTP在肝和腸表達,，在卵巢、睪丸和腎也發(fā)現(xiàn)有低水平MTp mRNA表達,。計算機輔助分析轉錄起始點上游743bp序列表明,，他與幾種已知順式作用元件同源，可調(diào)節(jié)MTP組織特性性表達,。在轉錄起始點第一個200bp序列含肝特異C/EBP,、HNF-1和HNF-5轉錄因子識別的上游啟動子元件，該區(qū)還含有通用轉錄因子Sp-1和Ap-1識別序列,。Sp-1,，C/EBP、HNF-1和HNF-5在該區(qū)的位點有單個堿基錯配,。其他比第一個200bp更上游的順式元件可被HNF-5,，C/EBP和CTF/NF-1識別。

　　MTP大亞基限制性片段長度多態(tài)性分析或簡單序列的串聯(lián)重復多態(tài)性分析,，均可用于調(diào)查MTP基因與異常血漿脂類或脂蛋白代謝的聯(lián)系,。CA雙核苷酸重復多態(tài)性在人基因組隨處可見，這種重復可用PCR分析,，因而是一種理想的基因標記,。為了識別CA雙核苷酸重復序列，用一個CA重復的探針來與MTP大亞基因進行雜交,，在內(nèi)含子10發(fā)現(xiàn)非完整CA重復結構(CA)4AA(CA)3GA(CA)4TA(CA)nTACA,分析18個不相關個體的36個等位基因表明有8種變異,，n從8到17。熒光原位雜交表明MTP大亞基基因位于4號染色體,，即4q28-q31,。

　　三、MTP生理功能和基因突變

　　脂質轉運蛋白促進膜間不溶性脂類分子轉運,，MTP的特性在于他剌激膜間中性脂類(甘油三酯,、膽固醇酯,、磷脂酰膽堿)轉運。脂質轉運蛋白也能促進膜間脂質分子交換或促進從一種膜向另一種膜凈轉運脂質分子,，雖然有例外,，但在體外分析表明脂質轉運蛋白一般是促進膜間脂質分子交換。當供體和受體膜間TG濃度相等時,，MTP能促進膜間交換TG,，而且當供體和受體膜間中性脂類濃度不平衡，中性脂類仍可轉移到受體顆粒,，表明MTP能凈轉運TG和CE,。MTP存在于肝細胞和小腸細胞微粒體腔內(nèi)，在富含甘油三酯的脂蛋白的正常組裝,、分泌中起有重要作用,。用MTP抑制劑研究表明，MTP在含ApoB48脂蛋白組裝的早期而不是晚期起作用,，光親和MTP抑制劑能阻斷McArdle RH-7777細胞分泌含ApoB的脂蛋白,，當這種細胞在缺乏MTP抑制劑和油酸時，貧脂質(HDL)的ApoB48顆?？梢孕纬?，但不能分泌。油酸加入這種培養(yǎng)細胞后可轉化成能分泌的富脂質的顆粒,。然而,，如果在貧脂復合體形成之后加入MTP光親和抑制劑，則對這種轉化或分泌過程沒有作用,。

　　1992年Wetterau J.R等報道無β脂蛋白血癥患者MTP活性和MTP蛋白缺陷,。SharpD.等1993年從一個無β脂蛋白血癥患者取小腸活檢，該患者是近親婚配的女性后代,，39歲,，用RT-PCR結合序列分析表明215位胞嘧啶缺失，導致發(fā)生移碼突變,，移碼突變導致在下游21個堿基處過早形成一個終止密碼,，并預測翻譯產(chǎn)物為78個氨基酸。進一步分析發(fā)現(xiàn)該患者是移碼突變的純合子,。從一個14歲女性無β脂蛋白血癥患者發(fā)現(xiàn)1783位C→T轉換,，這個突變使Arg密碼變成終止密碼，產(chǎn)生594個氨基酸的截短產(chǎn)物,。這個無義突變消除了一個TaqⅠ限制性內(nèi)切酶位點,。Southern雜交分析表明該患者為純合子，而其父母都是含正常和突變的雜合子。為檢測這些突變對MTP的影響,，將PDI和野生或突變MTP大亞基用桿狀病毒表達系統(tǒng)在sfq昆蟲細胞共同表達,。用表達PDI和野生MTP大亞基病毒共傳染sfp細胞，可產(chǎn)生有活性的MTP,。相反,，用表達PDI和突變MTP大亞基病毒共傳染sfq細胞，則不能產(chǎn)生有活性蛋白,，突變蛋白也形成不容性凝聚體,，不能與PDI結合。該結論可用解釋無β脂蛋白血癥患者的突變后MTP活性和MTP蛋白的缺陷,。到目前為止,，MTP大亞基的突變有碼突變、無義突變及點突變改變了MTP的正常剪接,。