一、血管平滑肌細(xì)胞的培養(yǎng)

　　血管平滑肌細(xì)胞培養(yǎng)常用的方法有貼塊法(explant)和酶解離法(enzyme disperse),。貼塊法具有獲得平滑肌細(xì)胞純度高,，量多，操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn),。但用貼塊法易使平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)肌絲喪失,，亞細(xì)胞器增加。相反,，酶解離法,，由于酶的作用使細(xì)胞間失去連接，細(xì)胞內(nèi)肌絲含量豐富,，保持收縮型狀態(tài),。培養(yǎng)平滑肌細(xì)胞常取材于兔、豬,、鼠,、猴的胸腹主動(dòng)脈段。

　　1.方法：動(dòng)物經(jīng)頸動(dòng)脈放血后,，在無(wú)菌操作下迅速取出胸腹主動(dòng)脈段,，置于含Hank's液的平皿中漂洗3次，將凝塊洗干凈后剝除外膜的纖維脂肪層,，然后縱行切開(kāi)血管,，刮除內(nèi)膜即內(nèi)皮細(xì)胞迅速撕下中膜內(nèi)、中層,，切成約1mm寬的小條,，浸泡在含血清的Hank's液中，并將撕下小組織塊種植于培養(yǎng)瓶壁,。置于37℃恒溫箱,，2h左右,，取出培養(yǎng)瓶加入20%胎牛血清的培養(yǎng)液，再放回培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)4天,。4天后可見(jiàn)細(xì)胞從組織中遷移游出,。

　　不同動(dòng)物血管結(jié)構(gòu)有差異，豬和猴較易操作,，但小動(dòng)物如兔,、鼠因其血管小，血管壁薄等特點(diǎn),，使之難以分離,。另外組織塊太薄，不易粘附培養(yǎng)基,，也使細(xì)胞較難生長(zhǎng)。為了保證培養(yǎng)的成功,，應(yīng)注意：①種植組織塊的數(shù)目,，如75cm2的長(zhǎng)頸瓶組織塊不得少于30個(gè);②根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞的種屬加入適量的不同血清，一般可加入牛血清,，若小牛血清增殖效果差,，應(yīng)加胎牛血清(FBS)，通常濃度為10%～20%;③培養(yǎng)基的選擇：常用的有DMEM(Dulbecco's modified Eagles'medium),，M199培養(yǎng)基,。培養(yǎng)兔的平滑肌細(xì)胞用DMEM效果較好。

　　2.酶解離法

　　沿動(dòng)脈縱軸切開(kāi)后,，刮除內(nèi)皮細(xì)胞撕下中膜的內(nèi)2/3,，注意不要混入內(nèi)皮細(xì)胞，將組織塊切成1-2mm2,，放入加有3mg/ml膠原酶的無(wú)血清M199培養(yǎng)基中,，37℃，0.5～1.5h,。離心去上清,，重復(fù)上述消化步驟，然后再離心(9000r,4min),，收集細(xì)胞,，在5%～10%同種血清或胎牛血清的M199培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞數(shù)，然后轉(zhuǎn)入30～90mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng),，對(duì)于兔子應(yīng)加入高濃度的谷氨酰胺(0.2g/L)較佳,。不同研究者在培養(yǎng)基、酶濃度以及消化時(shí)間等的選擇都有很大的差異,。

　　二,、動(dòng)脈平滑肌的特性

　　由于貼塊法和解離法處理方式不同，在細(xì)胞培養(yǎng)的最初階段細(xì)胞形態(tài)和性質(zhì)存在差異。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),，培養(yǎng)環(huán)境趨于一致,，細(xì)胞特性上也趨于近似。

　　光學(xué)倒置顯微鏡下觀察：原代平滑肌細(xì)胞形狀多樣,，一般常為梭形,、帶形、三角形或星形,。貼塊法培養(yǎng),，細(xì)胞可于2周后長(zhǎng)成單層;而酶解離只需6～7天，鏡下可見(jiàn)明顯“峰-谷”樣生長(zhǎng),。

　　透射電子顯微鏡下觀察：貼塊法,，細(xì)胞多為合成型，肌絲減少,，胞體縮小,，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、游離核糖體,、線粒體等亞細(xì)胞器逐漸增多,。消化法，細(xì)胞初期表現(xiàn)為收縮型,，細(xì)胞內(nèi)核位于中心,，胞質(zhì)內(nèi)含豐富的肌絲及致密度體。亞細(xì)胞器少,，且位于細(xì)胞邊緣處,，基底膜最初未見(jiàn)，后來(lái)逐漸形成,。傳代后,，細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)為合成型，胞體增大且變扁平,，核增大,，核小體數(shù)目增加，亞細(xì)胞器也增加,，肌絲開(kāi)始減少,，占胞內(nèi)35.4%～11.5%,甚至更少。

　　另外,，在體外實(shí)驗(yàn)中,，來(lái)自幼齡動(dòng)物(兔，豬)的血管平滑肌增殖生長(zhǎng)早且快,，相反,，老齡動(dòng)物則生長(zhǎng)緩慢,。在生化性質(zhì)方面，收縮型細(xì)胞比合成型細(xì)胞的β-極密度脂蛋白(β-VLDL)對(duì)其受體結(jié)合能力強(qiáng),，低密度脂蛋白(LDL)分解降低,，即脂質(zhì)容易在胞質(zhì)沉著。此外,，像基底膜中的肝素樣物質(zhì),、膽固醇代謝等也有改變。合成型細(xì)胞內(nèi)色素C氧化還原酶成倍增加,，酸性磷酸酶亦呈3～4倍增加,，說(shuō)明這兩類(lèi)細(xì)胞不僅在形態(tài)學(xué)上，在生化,、生理反應(yīng)方面也發(fā)生了較大改變,。