動脈粥樣硬化病灶主要涉及兩類血管細(xì)胞即血管內(nèi)皮細(xì)胞和中膜平滑肌細(xì)胞(SMC)，本節(jié)主要就這兩類細(xì)胞進行討論，介紹一般培養(yǎng)和鑒定方法,。

　　一,、血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)方法和特性

　　人和動脈不同部位、不同血管如大動脈與小動脈,、毛細(xì)血管,，以及靜脈血管之間存在差異，在處理這些細(xì)胞時應(yīng)分別對待,。血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)較小,，近似圓形，呈均勻排列,，一般取材于人和動物的臍帶,。

　　1.人大動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

　　人大動脈內(nèi)皮細(xì)胞可來自手術(shù)、病理活檢組織,，也可來自尸體(需在死后24h內(nèi)取材),，在取材過程中應(yīng)注意無菌操作。

　　(1)方法：小心剝除已游離的大血管外膜,，置于盛有冷的磷酸鹽平衡鹽溶液平皿中反復(fù)漂洗,，洗凈血管內(nèi)、外面的血液和脂質(zhì),，然后剪開血管,，放入37℃消化液中，60min,，消化結(jié)合后,，用23號針頭注射器吸取消化液沖洗血管內(nèi)腔，最后收集消化液置無菌試管中,，離心(1000rpm 7min)棄上清,，加入含血清培養(yǎng)基中，使細(xì)胞重新懸并調(diào)整細(xì)胞數(shù),，接種于相應(yīng)大小培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)皿中,，37℃恒溫溫箱培養(yǎng)，一周后內(nèi)皮細(xì)胞可長成單層,，呈多角形鋪成石狀排列,。

　　(2)注意事項：①如果小于23號針頭則回收內(nèi)皮細(xì)胞效果差，若針頭過大則注射器內(nèi)壓大會吸入緊貼內(nèi)皮細(xì)胞的平滑肌細(xì)胞,，因此注意使用恰當(dāng)?shù)尼橆^;②人血管內(nèi)皮細(xì)胞對營養(yǎng)條件要求高,，是依賴于生長因子的一種細(xì)胞。常用的培養(yǎng)基為RPMi 1640,，培養(yǎng)時添加15% FBS,，15%Nu-Serum,，5～20μg/ml的內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(ECGF)以及100μg/ml的肝素。改進的培養(yǎng)基有MCDB109培養(yǎng)基,，市場上也有內(nèi)皮細(xì)胞商品培養(yǎng)基,，可根據(jù)需要選擇購買;③培養(yǎng)基中必須加入相應(yīng)抗生素，最終濃度：慶大霉素為15μg/ml,，氨芐青霉素為50μg/ml,，二性霉素B1～2μg/ml，二甲胺四環(huán)素1μg/ml,。在48h內(nèi)可以防止細(xì)胞感染,，3日后還應(yīng)添加慶大毒素。此方法也適用于人大靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng),，但靜脈壁薄,，操作困難，細(xì)胞容易老化,。

　　2.高度動脈硬化的血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)動脈硬化血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng),，對培養(yǎng)基的要求同正常內(nèi)皮細(xì)胞，技術(shù)關(guān)鍵是分離細(xì)胞,。動脈硬化內(nèi)皮細(xì)胞層混有脂肪斑化,，粥樣腫脹的巨噬細(xì)胞。除去這種巨噬細(xì)胞最有效的方法是利用內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞比重的差異,，通過離心的方法達(dá)到分離的目的,。通常用淋巴細(xì)胞分離液，首先經(jīng)消化液處理,，將所得內(nèi)皮細(xì)胞的沉渣放入不含血清的8mlRPMi 1640液再漂浮后,，預(yù)先在另一試管加入5ml淋巴細(xì)胞分層液(比重1.0717)，再將細(xì)胞輕輕加入,。加完后,，800xg，23℃離心30min,，內(nèi)皮細(xì)胞沉著于管底,，巨噬細(xì)胞漂浮于上層。

　　3.臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

　　在嬰兒出生時立即將臍帶放置于無菌的500ml磷酸鹽溶液(PBS)中低溫保存,。次日分離細(xì)胞。臍帶有一根靜脈兩根動脈,，通常用內(nèi)腔大靜脈,。將洗凈的靜脈一端用夾子夾緊，一端注入消化液,，靜置孵育片刻,。然后PBS或培養(yǎng)液反復(fù)抽吸內(nèi)腔,，收集后與消化液一并離心、沉淀內(nèi)皮細(xì)胞,。所用培養(yǎng)基與大動脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基相同,，臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞、大動脈內(nèi)皮細(xì)胞易于培養(yǎng),，既使不加生長因子在最初幾代細(xì)胞也會增殖良好,。

　　二、血管內(nèi)皮細(xì)胞特性

　　1.血管內(nèi)皮細(xì)胞重要標(biāo)志

　　(1)第Ⅷ因子關(guān)連抗原(von willebrand factor,VWF),，可以由全身所有血管內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生,，檢測這一因子主要用相應(yīng)抗體。VWF有其特異性,，人的VWF抗體對牛的內(nèi)皮細(xì)胞沒有交叉反應(yīng),。兔疫熒光間接法測定該因子，陽性細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)長的熒光顆粒,，在核周圍的顆粒較密,，細(xì)胞邊緣顆粒較少。

　　(2)Weibel-Palade小體,，該小體是血管內(nèi)皮細(xì)胞又一特異性的標(biāo)志,。電子顯微鏡下，呈現(xiàn)0.1～0.3μm,長0.5～5μm的橢圓形棒狀結(jié)構(gòu),。上述的VWF就是該小體產(chǎn)生的,。

　　2.培養(yǎng)的大動脈內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)

　　培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞從形態(tài)學(xué)上可分為兩類。其一,，占培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的大部分,，直徑在50～70μm，類圓形或多角形的小型細(xì)胞,，這一類被稱為典型內(nèi)皮細(xì)胞,，呈單層鋪路石樣排列，占嬰幼兒,、青少年血管內(nèi)皮細(xì)胞的大部分,。另一類是直徑在100～200μm的大型內(nèi)皮細(xì)胞，這類細(xì)胞通常帶有兩個以上的細(xì)胞核,，被稱為非典型內(nèi)皮細(xì)胞,。非典型內(nèi)皮細(xì)胞是成人的大動脈內(nèi)皮細(xì)胞，與動脈硬化和老化有關(guān),。

　　一般來說,，血管內(nèi)皮細(xì)胞隨著年齡的增加，使典型的內(nèi)皮細(xì)胞慢慢地轉(zhuǎn)變?yōu)榉堑湫蛢?nèi)皮細(xì)胞;年齡越大,，非典型的內(nèi)皮細(xì)胞含量越高,。細(xì)胞生長方面,，動脈內(nèi)皮細(xì)胞比靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力強，嬰幼兒血管內(nèi)皮細(xì)胞比成人或高齡者內(nèi)皮細(xì)胞生長能力強,，體外培養(yǎng)的這兩種細(xì)胞與對照組細(xì)胞間存在顯著差異,。