一,、血管壁細(xì)胞提取

　　1.以無(wú)菌術(shù)取動(dòng)脈,，立即放入4℃,、5%水解乳蛋白Hanks液中漂洗，除去凝血,。

　　2.用小鑷剔除外膜纖維,、脂肪組織，用剪子沿血管壁縱向剪開(kāi)血管,，用Hanks液洗2次,。

　　3.可先分開(kāi)內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，也可不區(qū)分兩類細(xì)胞,，將血管切成小塊,，放入2%膠原酶，溫浴12～18h,。

　　4.梯度液選擇40%～70%,，40%梯度液應(yīng)是4份precoll、1份小牛血清,、5份BPS,，其他濃度配制與此相同。

　　5.把密度梯度液按從管底至管口密度梯度逐漸減少的順序鋪入試管,，將操作3.細(xì)胞液鋪于頂層,，4kr/min離心，收集各層細(xì)胞鑒定,。

　　二、細(xì)胞核提取

　　1.取制備血管細(xì)胞懸液放于試管中,，加五倍體積緩沖液(10mmol/l TrisHCL,pH7.4含10mol/L NaCl,1.5mmol/L Mgcl2),，加1%SDS10 μl用勻漿器輕輕勻漿。

　　2. 加蔗糖液(0.34mol/L,蔗糖10mol/LMgCl2)2份再勻漿1次,，下面鋪一層0.88mol/L蔗糖,，800g離心5min，收集沉淀部分,。

　　3.在0.88mol/L蔗糖液中再純化1次,，然后將細(xì)胞懸于10ml蔗糖液(0.34mol/L0.05mmol.LMgCl2)液中，用超聲波處理10S,。

　　4.將兩倍體積的0.88mol/L蔗糖加于上述處理液中,，800g離心30min收集沉淀部分。

　　5.將沉淀加入0.88mol/L蔗糖,，5kg離心1h,，沉淀部分為細(xì)胞核，將其保存于0.25mol/L蔗糖,，0.55mmol/LMgCl中備用,。

　　三、細(xì)胞膜的提取

　　1.取一定量酶處理的細(xì)胞，用勻漿器破碎,，操作要溫和,，使細(xì)胞膜保持完整。由于水與膜的疏水部分之間有反應(yīng),，因此要精確掌握分離介質(zhì)中的離心強(qiáng)度和滲透壓,，以每克細(xì)胞濕重加40ml介質(zhì)。

　　2.用Potter-Elvehiem勻漿器,，桿與壁間間隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下勻漿4～6次,，每次5S。

　　3.過(guò)濾勻漿液,，150g離心10min,，保留上清，沉淀部分加入50μl介質(zhì),，用勻漿器1kr/min勻漿3次,，150g離心10min，沉淀部分再加入上次勻漿的上清液,。

　　4.合并3次上清液,，2kg離心10min，棄上清,，沉淀部分溶于100μl介質(zhì),，離心10min，棄上清,，留沉淀,。

　　5.將沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分別置于三個(gè)離心管中,，上面依次疊加54%,、49%、45%,，41%,，37%蔗糖溶液各2、2,、5,、5、3份,。

　　6.700kg離心90min,，分離介質(zhì)在1.16～1.18之間形成介面。

　　7.收集d為1.16～1.18g/ml之間的細(xì)胞膜,，加30倍的介質(zhì)以2.5kg離心10min,，洗滌2次,。

　　8.保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5緩沖液中，用于細(xì)胞膜的研究分析,。

　　四,、溶酶體的分離

　　1.在梯度混合器的兩個(gè)小杯中分別加入2.1mol/L和1.1mol/L蔗糖(比例9：1)。

　　2.收集血管壁細(xì)胞,，用特制勻漿器1kr/min勻漿10次,。

　　3.以150g離心10min，上清液以同樣條件離心1次,，棄沉淀,，上清液以9kg離心3min棄上清液，

　　4.沉淀分三種不同顏色,，褐色為半純化的溶酶體,，中間黃褐色為線粒體部分，上層白色為膜成分混合物,。首先小心吸取上層,，然后加入0.3mol/L蔗糖數(shù)毫升，慢慢搖勻使界面層懸浮,，再用0.3mol/L蔗糖洗1次,。

　　5.將懸浮的半純化溶酶體鋪在梯度平面上，用玻棒攪勻最上層梯度液,，使溶酶體和梯度液之間的介面破壞,，然后以10kg離心15min，離心后可出現(xiàn)三條明顯的區(qū)帶及少許沉淀,，最下面黃褐色為純化的溶酶體,，中間黃色的為線粒體。

　　五,、線粒體的分離

　　1.漿分離的血管浸入緩沖液(250mmol/L甘露醇、0.5mmol/l EDTA,、 5mmol/L Hepes,、0.1%BSA、pH7.4)勻漿破碎細(xì)胞,，600g離心5min,，除去細(xì)胞核及碎片。

　　2.上清液在100kg離心10min,，留取沉淀部分,。

　　3.將沉淀部分懸浮于5ml操作1.的緩沖液中，加入5倍體積30%Percon,、225mmol/L甘露醇,、1mmol/L,，EDTA、25mmol/LHepes 0.1%BSA,5000g離心30min,。

　　4.將上述沉淀溶于適量10mmol/L KH2PO4,，pH7.4中，輕輕振蕩15min,。

　　5.加入10ml蔗糖液緩沖液(32%蔗糖,、30%甘油、10mmol/l MgCl2,、10mmol/L KH2PO4,，pH7.4)振蕩15min。

　　6.用BransonB-12超聲波碎儀60～70W處理2次,，每次15min,，12kg離心10min。

　　7.將沉淀部分溶于10倍體積緩沖液中并鋪于試管底層,，試管中層鋪成不連續(xù)蔗糖梯度(25.3%,、37.9%和51.3%)蔗糖各4mm厚，上層鋪上清液,。

　　8.2kg離心3h,，在25.3%/37.9%界面處為線粒體外膜，在51.3%蔗糖層分別回收內(nèi)膜和基質(zhì),。