一,、膠原的提取

　　動脈血管壁膠原提取的基本方法是，首先除去凝血等其他雜質(zhì),，由于膠原為桿狀三螺旋結構,，能耐受胃蛋白酶的作用，但是兩端球蛋白結構能被胃蛋白酶水解,。膠原纖維內(nèi)分子間的共價交聯(lián)是由分子末端賴氨酸或羥賴氨酸形成,，用胃蛋白酶切斷末端交聯(lián)結構，使膠原分子的巨形結構被破壞,，從完整分子可提出各種類型的膠原,。

　　(一)膠原的初步分離

　　1.小心取出動脈血管，用0.05mol/L BPS pH7.8洗凈凝血塊,，3kr/min離心10min,。

　　2.冷丙酮酸浸泡24h除去脂肪，蒸餾水洗滌3次,。

　　3.將組織破碎,，加三倍體積組織勻漿處理液(0.5mol/L乙酸，pH2.5,，1%胃蛋白酶)于4℃48h,16kr/min離心45min,，同樣方法重復3次。

　　4.向留取的上清液中緩緩加入NaCl,，最終達到4mol/L濃度,，攪拌12～24h,，15kr/min離心45min,，棄上清,。

　　5.進一步分離各種膠原可用分段鹽析和柱層析法進行操作。

　　(二)膠原的分段鹽析

　　1.取初級提取物加0.1mmol/L乙酸,，加NaCl至0.7mmol/L,，15kr/min離心20min。沉淀提?、?、Ⅲ、Ⅳ型膠原,，上清提?、簟ⅱ跣湍z原,。

　　2.沉淀,，加0.14mol/L PBS pH7.6,37℃保濕16h，10kr/min離心20min,，上清液加NaCl至4mol/L,，離心，沉淀物為Ⅳ型膠原,。

　　3.1mol/L NaCl溶解沉淀,，加3倍體積Tris-HCl pH7.4，10kr/min離心20min,，沉淀為Ⅲ型膠原,。

　　4.上清加NaCl至2.5mol/L,10kr/min離心20min，沉淀為Ⅰ膠原,。

　　5.取1.操作的上清加NaCl至1.2mol/L,15kr/min離心20min,。

　　6.沉淀溶于4倍體積1.0mol/L NaCl、0.05mol/l Tris-HCl pH7.4,，加NaCl至4mol/L 10kr/min離心20min,。

　　7.上清加NaCl至4mol/L，調(diào)pH到3.5,離心得沉淀再加5倍體積0.2mol/l NaCl,、1mol/L脲,、0.01mol/L Tris-HCl pH7.4的DEAE液懸浮16h，小心取上清加NaCl至4mol/L,，10kr/min離心10min,，沉淀為Ⅳ型膠原。

　　8.將6.沉淀部分加0.2mol/LNaCl,10.05mol/l Tirs-HCl pH7.4的DEAE懸浮16h,，上清加NaCl至4mol/l,10kr/min離心10min,，沉淀為Ⅴ型膠原,。

　　(三)將初步提取的膠原加到DEAE纖維柱上，用0.2mmol/l NaCl,、0.05mol/L Tris-HCl pH7.5的溶液洗脫,，230nm波長檢測洗脫物。因為膠原在pH7.5時均帶正電荷,，不與DEAE柱結合,，所以被柱結合的則為非膠原蛋白。

　　二,、蛋白多糖的提取

　　蛋白多糖具有可溶于4mol/L鹽酸胍的性質(zhì),，再經(jīng)DEAE-纖維素層析除去其他雜質(zhì)，非蛋白多糖與蛋白多糖用不同濃度尿素可分段層析分開,。

　　1.取動脈血管小心除去血管周圍脂肪組織和纖維膜,，用冷0.5mol/l PBS pH7.8洗滌，2kr/min離心10min,。

　　2.用勻漿器破碎,，加入15倍體積的提取液(0.05mol/L乙酸pH5.8、4.0mol/L鹽酸胍,、0.1mol/l6-氨基乙酸EDTA,、3mol/L芐脒)，于4℃緩慢振蕩24h,，10kr/min離心30min,。

　　3.取上清透析濃縮30倍。

　　4.將提取液加入已經(jīng)平衡好的DEAE-纖維素柱上,，分別用0.15mol/l NaCl和2mol/LNaCl洗脫,，均用280nm波長紫外監(jiān)測儀連續(xù)監(jiān)測。

　　三,、彈性蛋白的提取

　　提取方法較多,，各有優(yōu)缺點。1969年Bornstein和Ross先用5mol/L鹽酸胍抽提,，再用膠原酶水解其他非彈性蛋白組分,，最后還原二硫鍵，分離提取彈性蛋白,。具體方法如下：

　　1.將動脈血管壁洗凈,，小心除去附著結締組織。

　　2.將血管壁組織浸于4℃ 50%的吡啶液,，破碎組織,，3kr/min離心15min。

　　3.取沉淀用蒸餾水洗滌3次,，真空干燥后研成粉末,。

　　4.將粉末懸浮于2mol/L NaCl,4℃攪拌24h,，3kr/min離心20min，棄上清,，沉淀用蒸餾水洗3次,。

　　5.將沉淀用無水乙醇脫脂20min，用氯仿-甲醇(2：1)處理20min,，再用乙醚沖洗干燥,，3kr/min離心20min,，真空干燥沉渣,。

　　6.干燥的沉淀物用5倍處理液(0.5mol/LCaCl2、10.05mol/l Tris-HClpH7.5,、2%膠原酶)洗滌,，3kr/min離心20min。

　　7.將沉淀移入帶塞的瓶中,，加含0.5mol/L鹽酸胍,、0.1mol/l Tris-HClpH8.5、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇,，2.0mol/L EDTA液4℃過夜,。

　　8.3kr/min離心20min，沉淀用蒸餾水洗滌2次,。

　　9,，沉淀物加入處理液(6mol/L尿素、0.1%SDS,、0.05mol/L二硫赤蘚糖醇,、0.05mol/l Tris-HCl pH7.7)，通過氮氧真空過夜,，3kr/min離心20min,。

　　10.沉淀再真空干燥，即為彈性蛋白,。

　　四,、粘連蛋白的提取

　　提取粘連蛋白的基本原理是用NaCl脫氧膽酸鈉液提取血管壁中的粘連蛋白，再用高鹽除去雜質(zhì),，然后進一步用Sephacryl層析純化,，方法如下：

　　1.將動脈血管壁組織加10倍體積處理液(0.05mol/lTris-HCL pH7.6、0.5%核酸酶),，4℃攪拌20min,，10kr/min離心10min。

　　2.沉淀用含0.05mol/L Tris-HCl pH7.6,、0.5%PMSF,、10%甲醇液,，洗滌2次，10kr/min離心10min,。

　　3.沉淀物中,，加40倍體積處理液(0.05mol/lTris-HCl pH7.6、0.5%PMSF,、0.5mol/LNaCl,)4℃過夜后,，10kr/min離心10min。

　　4.上清用PEG6000濃縮,，最后加入已平衡好的SephacrylS-3000層析柱上,，用0.05mol/L Tris-HCl pH7.6、0.5%NaCl洗脫,，第一峰即為粘連蛋白,。