載脂蛋白CⅢ基因位于11號(hào)染色體與載脂蛋白AⅠ-AⅣ形成一基因族,，它位于載脂蛋白AⅠ下游,，有三個(gè)內(nèi)含子和四個(gè)外顯子。目前對(duì)載脂蛋白CⅢ基因3'末端非編碼區(qū)C-G對(duì)換產(chǎn)生一個(gè)Sac-Ⅰ酶切位點(diǎn)與冠心病的關(guān)系未有定論,。用多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增載脂蛋白CⅢ基因3'末端233bp，再用Sac-1酶切擴(kuò)增產(chǎn)物,，可以檢測(cè)載脂蛋白CⅢ基因3'末端的突變及其與動(dòng)脈粥樣硬化相關(guān)性,。本節(jié)采用PCR-RFLP檢測(cè)ApoCⅢ基因型。

　　一,、儀器與試劑

　　1.儀器：電泳儀,，基因擴(kuò)增儀。

　　2.試劑：TaqDNA聚合酶,，dNTP,，DNA參考物，Sca-1酶,。

　　二,、操作方法

　　1.模DNA提取

　　取用EDTA抗凝全血100μl加試劑(0.32mol/L蔗糖,，5mmol/l MgCl2,1%TritonX-100,0.01mol/L Tris-HClpH7.6)，振搖至溶解均勻透明,，3000r/min離心10min,棄上清,，沉淀部分加0.9NaCl溶液洗一次，加預(yù)冷試劑Ⅱ(75mmol/l NaCl,24mmol/L EDTA)100μl,，20%SDS15μl,，蛋白酶K10μl(6g/L)于65℃水浴4h，加200μl酚和氯仿：異戊醇(24：1)各提兩次,，上清加無水乙醇1.0ml放置于-20℃2h,，以12kr/min離心5min，真空干燥后加50μlTE緩沖液溶解,，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

　　2.多聚酶鏈反應(yīng)

　　Primer1：5'-GTGACC GAT GGC TTC AGT TCC CTG-3',，primer2:5'-GGt AGG AGAGCA CTC AGA ATA CA-3'。反應(yīng)總體積為50μl,，擴(kuò)增緩沖液所含物質(zhì)終濃度為：Tris-HCl,，pH8.3，67mmol/L;MgCl225mmol/L;KCl 50mmol/L;明膠0.01%,，dNTP各0.2～0.5μmol/L,，模板約10μg，加40μl液體石蠟,，94℃預(yù)變性4min,，加Tag聚合酶1.5U，以93℃1min,、65℃1.5min,、72℃1.5min，循環(huán)30次,。

　　3.擴(kuò)增產(chǎn)物酶切

　　取擴(kuò)增產(chǎn)物20μl加入NH4AC20μl,，再加300μl無水乙醇混均置-20℃1h，10000r/min離心7min棄上清,，干燥后加Sac-1酶液10μl37℃保溫2h,。

　　4.擴(kuò)增產(chǎn)物堿基對(duì)分子量測(cè)定

　　采用GB公司產(chǎn)DNamarker,以已知DNA片段bp數(shù)相對(duì)應(yīng)的電泳遷移距離，取半對(duì)數(shù)作圖制成標(biāo)準(zhǔn)曲線,，再根據(jù)等測(cè)定擴(kuò)增產(chǎn)物DNA片段移動(dòng)距離在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求出其bp數(shù),。

　　三、結(jié)果分析

　　采用本節(jié)設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增產(chǎn)物為ApoCⅢ基因3'非編碼區(qū)233bp,，該產(chǎn)物經(jīng)Sac-1酶切可出現(xiàn)三種結(jié)果;①酶切后仍為一條帶,，電泳遷移率未發(fā)生改變，為S1S1純合子;②酶切后除原始帶外又增加了兩條帶，查標(biāo)準(zhǔn)DNa marker曲線在158bp和75bp相同,，為S2S2雜合子;③酶切后原始帶消失,，出現(xiàn)兩條新帶，其電泳遷移率與158bp和75bp相同,，為S2S2純合子,。S2為擴(kuò)增的基因產(chǎn)物中C-G對(duì)換增加一個(gè)酶切位點(diǎn)。

　　檢查100名正常人中有S2雜合子28名,，純合子2名;68名冠心病人中S2雜合16名,，純合子4名，它們的頻率變化見表(19-4),。S2基因頻率兩組間無明顯差別,。

　　表19-4 載脂蛋白CⅢ基因Sac-Ⅰ酶切頻率表

　　級(jí)別n基因型頻 率

　　S1S1S1S2S2S2S1S2

　　正常人100702820.840.16

　　冠心病68481640.820.176

　　X=0.079,p>0.05(兩組比較)

　　(徐瓊)