ApoB是富含膽固醇和甘油三酯脂蛋白的重要組成成分,，對脂質(zhì)在人體轉(zhuǎn)運,、代謝、維持體內(nèi)脂質(zhì)水平的恒定起重要作用,。大量臨床資料及流行病學(xué)調(diào)查表明：血清ApoB及低密度脂蛋白(LDL)水平與動脈粥樣硬化呈正相關(guān),，是其主要危險因素之一。近十年來,，從分子水平研究ApoB,，闡明動脈粥樣硬化及高脂血癥的發(fā)病機理，尋找其遺傳標(biāo)志受到廣泛重視,，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)：ApoB基因具有明顯的多態(tài)性,，其核苷酸變異有75處，其中導(dǎo)致氨基酸變異的有54處,，例如多種酶限制性片段長度多態(tài)性(RFLPs),，3’端高變區(qū)的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)順序(VNTR)，信號肽(SP)多態(tài)性,。大量研究表明,，ApoB的基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化有不同程度的關(guān)系,。

　　一、分析ApoB基因多態(tài)性的方法

　　對ApoB基因多態(tài)性進(jìn)行檢測,、分析的方法很多,，如：限制性內(nèi)切酶的酶譜分析法，PCR直接分析法,，PCR產(chǎn)物RFLP分析法,，等位基因特異性寡核苷酸(ASO)雜交法等等，其中最多用且簡單的方法有PCR產(chǎn)物直接分析法和PCR產(chǎn)物RFLP分析法,。

　　PCR產(chǎn)物直接分析法,，是采用合適的引物，通過多次擴增,，獲得靶基因序列擴增片段,，直接分析法片段的大小，可用于分析基因的缺失與插入,。這種方法簡便,、快速、靈敏,，可分析ApoB基因VNTR,、SP多態(tài)性。

　　基因突變往往會造成限制性內(nèi)切酶識別位點的改變,，如位點丟失或產(chǎn)生新位點，通過PCR擴增某一特定片段,，再用限制性內(nèi)切酶酶切擴增產(chǎn)物,，電泳觀察片段的大小，這種方法用于檢測酶切位點改變的基因突變,，可直接判斷基因型,，是研究ApoB基因PFLPs的較好方法，具有靈敏,、簡便,、可同時對大量樣品進(jìn)行分析等優(yōu)點。

　　二,、ApoB基因多態(tài)性的檢測

　　ApoB基因多態(tài)性研究較多的有RFLP,、VNTR、SP多態(tài)性,，分別敘述如下：

　　1.RFLP的檢測

　　ApoB有10種RFLP,，一般采用PCR-RPLPs方法進(jìn)行分析，研究較多的有第26外顯子XbaⅠ,、MspⅠ位點,，第29外顯子EcoRⅠ位點,，在Apob DNA上的位置如圖19-6，圖19-7所示：

　　圖19-6 ApoB基因部分RFLPS示意圖

　　圖19-6 ApoB基因多態(tài)性位置示意圖

　　用于PCR的引物如下：

　　XbaⅠ-5’GGAGACTATTCAGAAGCTAA

　　XbaⅠ-3’GAAGAGCCTGAAGACTGACT

　　EcoRⅠ-5’CTGAGAGAAGTGTCTTCGAAG

　　EcoRⅠ-3’CTCGAAAGGAAGTGTAATCAC

　　MspⅠ-5’TCTCGGGAATATTCAGGAACTATTG

　　MspⅠ-3’CTAAGGATCCTACAATGTCAAGGT

　　XbaⅠ酶切位點的RFLP是由于2488位密碼子第三個堿基突變(ACC→ACT),，產(chǎn)生一個XbaⅠ酶切位點,，但并未改變所編碼的氨基酸序列，存在XbaⅠ酶切位點(X+)的等位基因,，其PCR產(chǎn)物酶切后出現(xiàn)433bp和277bp兩個片段,，不存在XbaⅠ酶切位點(X-)的等位基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)酶切后仍為其產(chǎn)物710bp片段,。

　　RFLP是由于4154位密碼子改變(GAA→AAA),，使原有的EcoRⅠ酶切位點消失，氨基酸序列中賴氨酸取代谷氨酸,，存在EcoRⅠ酶切位點(R+)的等位基因,，其PCR產(chǎn)物經(jīng)EcoRⅠ酶切后得到253bp及227bp兩個片段，不存在EcoRⅠ酶切位點(R-)的等位基因,，其PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp的片段,。

　　MspⅠ酶切位點的RFLP，是由于3611位密碼子改變(CGG→CAG),，谷氨酰胺取代了精氨酸,，含MspⅠ酶切位點(M+)的等位基因，PCR產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后可見到395bp和85bp的片段,，不含MspⅠ酶切位點(M-)的等位基因,，PCR產(chǎn)物酶切后仍為480bp。

　　眾多學(xué)者對ApoB基因RFLPs與動脈粥樣硬化之間的關(guān)系進(jìn)行了研究,。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為ApoE有XbaⅠ酶切位點(X+),，無EcoRⅠ酶切位點(E-)，無MspⅠ酶切位點(M-)的基因頻率,，在動脈粥樣硬化性疾病的患者中比正常對照組高,，但也有學(xué)者持不同甚至相反意見，究其原因,，可能有以下幾點：①研究樣品例數(shù)不夠,，有的少于100個甚至少于50個，可能使一些有意義的聯(lián)系被忽略;②對照組的選擇沒有統(tǒng)一的,、嚴(yán)格的,、明確的標(biāo)準(zhǔn)，有時與病員組缺乏可比性;③存在種族差異,，例如XbaⅠRFLP基因頻率,，X+等位基因在高加索人為0.4～0.5,日本人和中國人則僅為0.04、0.01;④某些遺傳標(biāo)記之間可能存在連鎖關(guān)系，可導(dǎo)致結(jié)論互不相同,。

　　2.VNTR的檢測

　　VNTR(數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)順序)是繼RFLPs之后的又一類具有高度多態(tài)性的遺傳標(biāo)記,，廣泛分布于人類基因組中。ApoB基因3’端高變區(qū)(HVR)包含VNTR,，由富含AT的DNA序列組成,，其多態(tài)性特點是由10～15bp的核苷酸序列構(gòu)成不同的等位基因，產(chǎn)生不同的重復(fù)序列拷貝數(shù),。以VNTR兩側(cè)特異性序列為引物,，經(jīng)PCR擴增后直接電泳分析產(chǎn)物，片段之間的差異在于AT重復(fù)次數(shù)不同,，重復(fù)37次稱為3β'37,。依此類推，PCR引物可用以下序列：

　　VNTR-5’ATGGAAACGGAGAAATTATG

　　VNTR-3’CCTTCTCACTTGGCAAATAC

　　Boerwinkle等首先檢測出12種等位基因片段,，現(xiàn)有學(xué)者已檢出22種不同等位基因,。Frield等的研究發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)生38,、44,、46或48個15bp長度重復(fù)序列的等位基因與冠心病、血漿膽固醇水平升高有關(guān),，且與EcoRi RFLP呈連鎖不平衡,，與MspⅠRFLP呈連鎖平衡，Robinson等的研究則沒有發(fā)現(xiàn)ApoB的VNTR多態(tài)性與血漿膽固醇,、甘油三酯,、ApoB等水平有關(guān)。

　　3.信號肽(SP)多態(tài)性的檢測

　　ApoB基因5’信號肽(SP)由27個(插入型Ins)或24個(缺失型Del)氨基酸組成,，可經(jīng)PCR擴增后直接分析,，用于PCR的引物序列為：

　　IN/DE-5’CAGCTGGCGATGGACCCGCCGA

　　IN/DE-3’ACCGGCCCTGGCGCCCGCCAGCA

　　Wu等報告del/del基因型在高膽固醇血癥患者中比對照組中多見。Renges等對倫敦地區(qū)亞洲后裔的研究也發(fā)現(xiàn)帶del基因型者血漿總膽固醇升高,，但與冠心病無明顯關(guān)系。Peacock等提出Ins/del多態(tài)性與冠心病的發(fā)展,，即其嚴(yán)重程度有關(guān),，也有報道Ins/del多態(tài)性在冠心病與對照組中無明顯差別。

　　三,、ApoB基因多態(tài)性檢測方法舉例

　　以ApoB基因第26個外顯子MspⅠ RFLP為例,，具體介紹檢測的方法和步驟，筆者對湖北地區(qū)健康成人(120例)進(jìn)行了檢測,。

　　(一)材料

　　引物(如前所述),，TaqDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶MspⅠ,、高速離心機,、基因擴增儀、恒溫水浴箱,、電泳系統(tǒng),、紫外監(jiān)測儀。

　　(二)方法

　　1.模板DNA的提取

　　可采用改良的TritonX-100法提取人白細(xì)胞DNA,，此法結(jié)果穩(wěn)定,，但操作較繁瑣，在此采用改進(jìn)的Na裂解法提取人白細(xì)胞DNA,，簡便,、快速、靈敏,、經(jīng)濟(jì),，步驟如下：

　　取EDTANa2抗凝血100μl，15000r/min離心5min,，棄上層血漿,，加無菌雙蒸水200μl，搖勻20s,，加6mNaI200μl,，搖勻20s，再加入氯仿/異戊醇(24/1)400μl,，搖勻后15000r/min離心12min,，小心吸取上層水相，移入另一離心管,，加0.6倍體積的異丙醇,，混勻后4℃放置15min，15000r/min離心12min,，棄異丙醇,，加入70%乙醇洗滌2～3次，室溫干燥,，加入5μlTE緩沖液(pH=8.0)溶解DNA12～24h,，4℃?zhèn)溆谩?/p>

　　2.模板DNA的擴增

　　采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)。反應(yīng)總體積50μl,，MgCl2終濃度為1.5mmol/L的1×Buffer,dNTp 0.2mmol/l,，引物各20pmol,模板DNA約1.0μg，混勻,，短暫離心,，95℃預(yù)變性10min,，加入Taq酶1.5U，液體石蠟50μl,，短暫離心,，按94℃ 45sec，60℃ 45sec,72℃1mim 15s循環(huán)30次,，72℃延伸5min,，置4℃貯存。

　　3.擴增產(chǎn)物的提純及酶切

　　取擴增產(chǎn)物20μl,，加入醋酸銨至2.5mol/L,與無水乙醇混勻,，4℃沉淀15min，12000r/min離心10min,，棄上清,，70%乙醇漂洗兩次，室溫干燥后加入含Mspi 10U的緩沖液37℃保溫2h,，加入EDTA至10mmol/L終止反應(yīng),。

　　4.擴增及酶切產(chǎn)物的檢測

　　(1)瓊脂糖電泳：制備2%瓊脂糖(含0.5μg/ml EB)，將擴增產(chǎn)物與標(biāo)準(zhǔn)DNA(PGEM3zf(+)/HaeⅢ)點樣,，電壓4v/cm,，電泳，紫外燈下觀察,。

　　(2)聚丙烯酰胺凝膠電泳：將擴增及酶切產(chǎn)物加樣于8%聚丙烯酰胺凝膠上,，電壓6V/cm，電泳4h,，EB染色,，紫外燈下觀察。

　　(3)結(jié)果：擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳,，紫外燈下呈一條強熒光帶,，與已知DNa Marker相比較，約位于480bp的位置,，與設(shè)計相符,。

　　擴增產(chǎn)物經(jīng)MspⅠ酶切后，在8%PAGE上,，可見到三種類型：①原始帶消失,，出現(xiàn)兩條新帶，長度為395bp和85bp,，為含酶切位點的M+M+純合子;②酶切后除與擴增產(chǎn)物相同位置的原始帶外，還有兩條長度為395bp和85bp的帶,，共三條帶,，為M+M-雜合子;③酶切后僅有一條帶，與擴增產(chǎn)物位置相同，為無酶切位點的M-M-純合子,。

　　以上三種基因型,，以含酶切位點的純合型(M+M+)最多見，120例中有114例,，不含酶切位點的M-M-型最少見,，僅有1例，雜合型(M+M-)有5例,，根據(jù)基因頻率計算方法,，等位基因M+頻率為0.97，少見等位基因M-頻率為0.03,。

　　若對冠心病患者同時進(jìn)行檢測,，計算基因頻率，可見到：少見等位基因M-在冠心病組比健康對照組高,，有顯著性差異,，但無論在冠心病組還是健康對照組，各基因型個體間的血脂,、脂蛋白,、載脂蛋白水平均無顯著性差異，這說明Apob MspⅠ多態(tài)性與冠心病有關(guān),，但與血中脂類水平的關(guān)系不明顯,，這可能是由于環(huán)境因素，激素及其他遺傳因素對脂質(zhì)水平的影響較明顯,，掩蓋了Apob MspⅠRFLP對脂質(zhì)的影響,，也可能是這種多態(tài)性與ApoB基因上其他位點的多態(tài)性有連鎖關(guān)系。另外,，由于少見等位基因M-的頻率很低,，有必要加大樣本例數(shù)，進(jìn)行進(jìn)一步的研究,。