一,、原理

　　當(dāng)光線通過一個(gè)渾濁介質(zhì)溶液時(shí),，由于溶液中存在混濁顆粒，光線被吸收一部分,，吸收的多少與混濁顆粒的量成正比,，這種測(cè)定光吸收量的方法稱為透射比濁法。這一方法早于1959年Schultre和Schuick等報(bào)道應(yīng)用于血漿蛋白與其抗體結(jié)合后形成復(fù)合物,，導(dǎo)致濁度的改變,，再進(jìn)行透射比濁測(cè)定，一般采用抗體對(duì)抗原定量的透射比濁法,，稱為免疫透射比濁法,。其原理是，利用抗原和抗體的特異性結(jié)合形成復(fù)合物,，通過測(cè)定復(fù)合物形成量的多少對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定量的方法,。在介質(zhì)溶液中，抗原與特異性抗體在一定條件下才能形成復(fù)合物,，一定的條件包括：①對(duì)抗體的要求,，作為體液或組織中蛋白質(zhì)種類很多,，若要快速特異檢測(cè)，要求有單價(jià)特異抗體才能與抗原形成復(fù)合物,。某一種蛋白質(zhì),，有其特異抗體才能與該抗原結(jié)合，形成免疫復(fù)合物進(jìn)行定量,，若抗體不純混雜有另一種或兩種少量的抗體,，這種免疫復(fù)合物就不是單一復(fù)合物而是大雜燴，結(jié)果偏高;②抗原抗體比例適當(dāng),，因免疫復(fù)合物形成有三個(gè)階段,，第一階段是復(fù)合物形成抗原抗體復(fù)合物;第二階段是初步形成抗原抗體復(fù)合物，此階段是復(fù)合物交聯(lián)成大的網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu);第三階段是復(fù)合物聚合產(chǎn)生絮狀沉淀,。只有在抗原與抗體等價(jià)時(shí)即無過?？贵w，此時(shí),，復(fù)合物的結(jié)合與解離處于平衡狀態(tài)，其混濁程度達(dá)高峰,。在抗體過量時(shí),，隨抗原量的增加而復(fù)合物形成也增加，其測(cè)定只能在反應(yīng)曲線的左側(cè)進(jìn)行(見圖18-4);③一般要求溶液中有非離子性親水多聚體促進(jìn)免疫復(fù)合物的形成,，如聚二乙醇6000等,。溶液pH為6.5～8.0之間為宜。載脂蛋白有形成兩性螺旋片(amphipathic helix)的特性,，對(duì)脂質(zhì)(特別是磷脂)有高度親和力,，與脂質(zhì)結(jié)合后有時(shí)會(huì)掩蓋抗原位點(diǎn)或構(gòu)象改變，可以部分或完全喪失對(duì)抗血清的特異反應(yīng),。為此,，載脂蛋白檢測(cè)過程中有必要先暴露抗原位點(diǎn)，所用試劑有表面活性劑,，尿素,，鹽酸胍和吐溫等解離蛋白劑，或用四甲基脲脫脂或有機(jī)溶劑脫脂等暴露抗原決定簇等方法,，血清脂蛋白顆粒中的載脂蛋白,，能在短時(shí)間內(nèi)形成抗原抗體復(fù)合物進(jìn)行定量;④抗原不能過量，因?yàn)榭乖^量,，抗原抗體復(fù)合物形成不但不增加,，反而會(huì)減少，光散射或光吸收減少,，檢測(cè)結(jié)果反而偏低,。

　　圖18-4 抗原抗體反應(yīng)曲線

　　在免疫比濁過程中,，由于抗原抗體結(jié)合的三過程，從而導(dǎo)致光密度與濃度之間不呈線性關(guān)系,，一般是3次方程曲線關(guān)系,。若將抗原與抗體兩個(gè)變量之間的變動(dòng)特征恰當(dāng)?shù)胤从吵鰜恚枰?jīng)過3次方程擬合成近似直線化的曲線方程,，再進(jìn)行運(yùn)算,，免疫比濁中，采用終點(diǎn)法或速率法,，用5個(gè)或7個(gè)不同梯度進(jìn)行定標(biāo),，經(jīng)3次曲線方程求出一條能反映真實(shí)情況的濃度與光密度的關(guān)系曲線方程，才能作為定量的工作曲線,。

　　二,、血清ApoAⅠ(B100)透射比濁測(cè)定法

　　脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒，分散于溶液介質(zhì)中,，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其混濁程度,，進(jìn)行ApoAⅠ(B100)的定量測(cè)定。

　　(一)手工操作

　　1.原理

　　血清ApoAⅠ(B100)+抗人ApoAⅠ(B100)→抗原抗體復(fù)合物→測(cè)定光密度

　　2.試劑(伊利康)

　　(1)Apo緩沖液(RⅠ),，含4%PEG6000和表面活性劑

　　(2)羊抗人ApoAⅠ(B100)抗體液(RⅡ)：監(jiān)用前取抗血清200μl,，加0.9%NaCl液700μl，混勻,，待用,，置冰箱一周內(nèi)有效。

　　(3)ApoAⅠ(B100)參考血清(RⅢ)

　　3.操作

　　(1)按ApoAⅠ抗血清液或ApoB100抗血清100μl,，加相應(yīng)的Apo緩沖液0.9ml的比例混合成單一試劑(Apo抗體液),。最好臨用前配制當(dāng)天用量。

　　(2)各試劑用量如下表

　　ApoAⅠApoB100

　　標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管標(biāo)準(zhǔn)管測(cè)定管空白管

　　參考血清5μl　　5μl

　　待測(cè)血清　5μl　　5μl

　　ApoAⅠ抗體液1.0ml1.0ml1.0ml

　　ApoB100抗體液　　　1.0ml1.0ml1.0ml

　　混勻各管,，37℃保溫10min,，波長(zhǎng)340min，于半自動(dòng)分析儀上先吸入空白管液,，再吸入標(biāo)準(zhǔn)管,，儀器根據(jù)光密度及參考值得出一換算系數(shù)，再吸入測(cè)定管,，儀器內(nèi)根據(jù)光密度及系數(shù)進(jìn)行運(yùn)算,，打印結(jié)果。

　　(3)定標(biāo)方法,，根據(jù)免疫比濁法原理,，應(yīng)取多點(diǎn)(3～9點(diǎn))，按y=a+bx+cx2+dx3的3次方程回歸曲線進(jìn)行定標(biāo),，制作參考工作曲線,。

　?、傩Ｕぷ髑€的繪制：

　　配制抗血清稀釋工作液：按RⅠ試劑0.9ml，加RⅡ試劑100μl的比例(Apo抗體液)混勻,，待用,。

　　制備5點(diǎn)校正液：取RⅢ(參考血清)，用0.9%生理鹽水倍比稀釋成5個(gè)濃度,，第5管為原參考血清濃度,，其他4管分別為第5管的1/2、1/4,、1/8,、1/16(或濃度為0即0.9%NaCl)。

　　表18-20 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備的各管(點(diǎn))濃度

　　管號(hào)12345

　　1號(hào)管(0)(μl)5

　　2號(hào)管(1/8)(μl)　5

　　3號(hào)管(1/4)(μl)　　5

　　4號(hào)管(1/2)(μl)　　　5

　　5號(hào)管(1/1)(μl)　　　　5

　　Apo抗體液(ml)1.01.01.01.01.0

　　混勻各管,，置37℃水浴保溫10min,，按程序上機(jī)作工作曲線。

　?、跇?biāo)本測(cè)定：吸待測(cè)血清(測(cè)定管)5μl,，加上述稀釋抗血清工作液1.0ml，于37℃水浴保溫10min,，上機(jī)讀數(shù),，打印結(jié)果。

　?、廴鐪y(cè)定值超過工作曲線上限值,，儀器會(huì)打印顯示“過高”,，此時(shí),，將待測(cè)標(biāo)本稀釋1倍再測(cè)。

　?、苊颗?hào)的抗血清應(yīng)作一次多點(diǎn)定標(biāo),，即測(cè)定標(biāo)本的抗血清應(yīng)與定標(biāo)的抗血清是同一批號(hào)抗血清。

　　(二)生化分析儀測(cè)定

　　1.原理

　　脂蛋白抗原在溶液中與相應(yīng)特異抗體形成抗原抗體復(fù)合物的混濁顆粒分散于溶液介質(zhì)中,，在一定波長(zhǎng)下測(cè)定其混濁程度,，進(jìn)行ApoAⅠ(B100)的定量測(cè)定。

　　ApoAⅠ(B100)+抗人ApoAⅠ(B100)→抗原抗體復(fù)合物→測(cè)定吸光光密度

　　2.雙試劑單(雙)波長(zhǎng)法

　　(1)試劑(溫州伊利康)

　　RⅠ：Apo緩沖液,，含4% PEG6000和表面活性,。

　　RⅡ：羊抗人ApoA(B100)稀釋抗血清

　　RⅢ：Apo定值血清

　　(2)各試劑及標(biāo)本用量如下表：

　　項(xiàng)目血清Apo緩沖液

　　(RⅠ)ApoAⅠ抗血清液

　　(RⅡ)ApoB100抗血清液

　　(RⅡ)

　　ApoAⅠ2～5μl300～350μl80～100μl

　　ApoB1002～5μl300～350μl　80-100μl

　　(3)定標(biāo)：以5點(diǎn)Apo梯度濃度，采用免疫定標(biāo)法按表18-21參數(shù)上機(jī)定標(biāo),，如圖18-5所示,。

　　圖18-5 ApoAⅠ 五點(diǎn)免疫定標(biāo)曲線圖(以CL-7200儀器為例)

　　(4)上機(jī)(終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法)

　　(5)說明：①Apo測(cè)定的光密度從340～700nm范圍都可采用，多用340nm;②國(guó)內(nèi)已有的Apo試劑盒均無需處理;③血清標(biāo)本也無需處理,，均可直接檢測(cè);④本法適用于多種類型的全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè),，自動(dòng)扣除空白,，快速準(zhǔn)確;⑤效價(jià)不同的抗血清，其用量應(yīng)作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整,。

　　(5)計(jì)算△A=A2-A1,以△A值采用免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算,。

　　3.單一試劑單波長(zhǎng)法

　　(1)試劑同雙試劑法

　　(2)標(biāo)本及試劑用量:按ApoAⅠ抗血清液或ApoB抗血清液(RⅡ)100μl,加相應(yīng)的Apo緩沖液(RⅠ)0.3ml的比例混合成單一試劑(Apo抗體液)。最好臨用前配制當(dāng)天用量,此抗體液置2～8℃保存一周有效,。

　　(3)定標(biāo)：按五點(diǎn)梯度稀釋定值血清(見表18-21),，以終點(diǎn)法或兩點(diǎn)法進(jìn)行免疫定標(biāo)。

　　(4)按以下步驟操作：

　　(5)以△A=A2-A1值按免疫定標(biāo)自動(dòng)運(yùn)算,。

　　(6)說明：①該法一般用半自動(dòng)生化分析儀;②通過設(shè)延遲時(shí)間以扣除空白;③RⅠ,、RⅡ試劑以臨用時(shí)混合為好，未用完的混合試劑應(yīng)置于2～8℃冰箱保存,，只允許使用一周;④血清標(biāo)本無需再處理,。

　　4.ApoAⅠ、AⅡ,、B,、CⅡ、CⅢ和E的全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)的有關(guān)數(shù)據(jù),。

　　(1)上機(jī)參數(shù)(以CL-7200型為例)如表18-21所示,。

　　表18-21 自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)Apo有關(guān)參數(shù)

　　ApoAⅠAⅡBCⅡCⅢE

　　反應(yīng)類型終 點(diǎn)法

　　樣品量3μl3μl3μl8μl3μl5μl

　　測(cè)量波長(zhǎng)600nm(第一)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)700nm700nm700nm

　　700nm(第二)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)340nm340nm340nm

　　反應(yīng)時(shí)間第一波長(zhǎng)5min數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)

　　第二波長(zhǎng)4.99min數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)數(shù)據(jù)

　　試劑Ⅰ350μl290μl350μl300μl290μl350μl

　　試劑Ⅱ100μl75μl100μl50μl75μl50μl

　　單位g/Lg/Lg/Lmg/dlmg/dlmg/dl

　　標(biāo)準(zhǔn)濃度點(diǎn)數(shù)555555

　　(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線制備參數(shù)如表18-22所示。

　　表18-22 生化分析儀檢測(cè)Apo的定標(biāo)濃度

　　標(biāo)準(zhǔn)管號(hào)123456

　　稀釋倍數(shù)01：21：41：81：160

　　ApoAⅠ度數(shù)(g/L)172864321.510.80

　　ApoAⅡ度數(shù)(g/L)361894.52.250

　　ApoB濃度(g/L)1809145.522.611.30

　　ApoCⅡ濃度(mg/dl)4210.50.250

　　ApoCⅢ濃度(mg/dl)52.51.250.630.310

　　ApoE濃度(mg/dl)1052.51.250.6250

　　5.單一試劑和雙試劑檢測(cè)方法的比較

　　單一試劑和雙試劑在全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定的光密度變化過程,，如圖18-6所示,。

　　從理論上考慮任何一種生化測(cè)定方法的試劑，臨用時(shí)混合最好,，可以消除試劑各種成份的自身化學(xué)變化和相互影響,。而在實(shí)際工作中，是不可能的,，只能是將幾種不會(huì)起化學(xué)反應(yīng)而又無相互影響的試劑配制成2～4種,，臨用時(shí)按一定比例配制使用。臨床化學(xué)試劑盒,，目前主要以1或2種試劑形式供醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)使用,，即單一試劑和雙試劑兩種形式。

　　筆者認(rèn)為雙試劑比單一試劑好,，尤其是含酶試劑和免疫試劑以雙試劑包裝形式為好,，有利于對(duì)酶的活性或抗體效價(jià)的保存。單一試劑是所有試劑混合在一起,，存放過程中,，有可能因化學(xué)物質(zhì)的存在而損害試劑中的工具酶或抗體，存放時(shí)間越長(zhǎng),，損害可能性越大,，然而雙試劑不存在這一問題,。

　　對(duì)脂質(zhì)的測(cè)定雙試劑法更顯其優(yōu)越性，因?yàn)檠逯兄|(zhì)與載脂蛋白是以脂蛋白的形式存在,，當(dāng)測(cè)定試劑與血清標(biāo)本混合后,，首先解聯(lián)脂蛋白，讓其釋放出脂質(zhì)和載脂蛋白,，,。作為免疫測(cè)定試劑還兼有使載脂蛋白抗原決定簇暴露的作用。當(dāng)R1試劑作用完后,，加進(jìn)第二試劑(R2)后,，使其抗體適應(yīng)抗原決定簇的要求，達(dá)到抗原抗體結(jié)構(gòu)呈完全的互補(bǔ)狀態(tài),，從而產(chǎn)生最大的抗原抗體結(jié)合量,，達(dá)到定量的目的。雙試劑測(cè)定法,，既能自動(dòng)扣去空白,，又能使化學(xué)反應(yīng)快速進(jìn)行，從而迅速地完成檢測(cè)的全過程,。

　　圖18-6 單雙試劑法反應(yīng)過程的光密度變化曲線圖

　　A：雙試管法;B：為單一試劑法

　　(賀小玲　胡漢寧)