抗原免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體是血清γ-球蛋白的一部分,?？贵w的理化性質(zhì)及結(jié)構(gòu)與γ-球蛋白相近似。γ-球蛋白是一組結(jié)構(gòu)相似,，但又有差異的蛋白質(zhì),，通稱為免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)，按其結(jié)構(gòu)和免疫化學(xué)性質(zhì)的差異,，又可分為五類,，分別稱為IgG、IgA,、IgM,、IgD和IgE。載脂蛋白抗體以IgG最為穩(wěn)定,。因載脂蛋白的體液中含量不同以及分離純化的難易的差別，可分別采用多克隆抗體制備法和單克隆抗體制備法,。

　　1.多克隆抗體的制備

　　(1)抗原

　　目前所知的載脂蛋白進(jìn)入異種機(jī)體后,，能致敏淋巴細(xì)胞，與抗體產(chǎn)生特異性結(jié)合復(fù)合物,，即具備有抗原性,。抗原性包括免疫原性和抗原特異性兩方面的含義,。載脂蛋白因具備抗原特異性和免疫原性,，因此可稱為完全抗原，大多數(shù)動(dòng)物的免疫系統(tǒng)是非常敏感的,，用于免疫的抗原僅需要極微量,。抗原應(yīng)該是純化品,，該純品在12.5%的PAG電泳后,，僅出現(xiàn)一條區(qū)帶，即認(rèn)為可用于免疫抗原純品,。

　　(2)免疫

　　動(dòng)物的選擇：通常選擇壯年,、成熟且健壯的豚鼠、雞,、兔,、山羊、綿羊,、馬等動(dòng)物,。一般多先用大白兔,。作為批量生產(chǎn)，以采用山羊或綿羊,，若需量再多,，可考慮用馬作為免疫動(dòng)物。因動(dòng)物個(gè)體差異的關(guān)系,，即使是用一種抗原去免疫多個(gè)白兔,，所得抗血清特異性會(huì)有很大的差別。因此,，為了得到比較一致的抗血清,，常用能產(chǎn)生大量抗血清的羊或馬為免疫動(dòng)物。

　　佐劑：佐劑是指與抗原混合注入機(jī)體后,，能增加抗原的免疫性或者能改變免疫反應(yīng)類型的一種物質(zhì),。人們公認(rèn)的佐劑是福氏佐劑(Freund’adguvant)，具有明顯的免疫剌激作用,。福氏佐劑又可分為兩種,，即不完全佐劑和完全佐劑，屬于一種油包水的乳劑,，由羊毛脂或甘露糖醇單油酸酯(arlacela)為乳劑,。油包水乳化劑有助于促進(jìn)免疫反應(yīng)的進(jìn)行，還可起部分保護(hù)不穩(wěn)定抗原的作用,，使抗原在體內(nèi)的吸收期延長(zhǎng),，從而減少加強(qiáng)注射的次數(shù)。在不完全佐劑內(nèi)加入殺死的分枝桿菌(如結(jié)核桿菌或卡介苗)制備成完全佐劑,。分枝桿菌能增加局部淋巴結(jié)的炎癥反應(yīng),，擴(kuò)大免疫原性，從而促進(jìn)最終高親和力抗體的形成,。佐劑有成品購(gòu)買,，也可自行制備。佐劑制備方法是,，取石蠟油6份,、羊毛脂4份，再加5份不含抗原的抗原緩沖液(含0.1%SDS),混勻,，滅菌,，分裝于小玻璃瓶中，0～8℃保存,，此為不完全佐劑,。在不完全佐劑中加入卡介苗(3～5mg/0.5ml)即為完全佐劑，均貯存于0～8℃,。臨用時(shí),，取完全佐劑3份加入含抗原的緩沖液1份,，混勻，振搖或研磨,，使其成為乳化狀態(tài),，因?yàn)楹琒DS很易促使其乳化成油包水抗原乳化復(fù)合物，注射入動(dòng)物體內(nèi)時(shí)一定要保持乳化狀態(tài),?？乖昧恳暱乖肿恿坎煌懊庖咴约懊庖邉?dòng)物不同而有一定差異，無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)和固定模式,。一般是每兔(約2kg重)或每羊(約20kg重)第1次注射抗原1mg,，以后逐次增加抗原量，最多每次不超過(guò)3mg,。

　　免疫途徑及方法：免疫部位可分別選用皮內(nèi),、皮下或淋巴結(jié)。第1次免疫采用皮內(nèi)結(jié)合皮下多點(diǎn)注射,，常注射在背部或腿部,。許多作者介紹在后足蹠皮下或皮內(nèi)注射，因?yàn)樗淖懵涞氐年P(guān)系很易造成感染,，使第1次免疫失效,，并使動(dòng)物行走不便，造成傷害,。整個(gè)免疫過(guò)程以2～3個(gè)月為宜。一般是第1次免疫后的3～4周再進(jìn)行第2次免疫,，不完全佐劑為乳化劑,。2周后加強(qiáng)1次(不完全佐劑)，2周后又加強(qiáng)1次(不完全佐劑或完全佐劑),，1周后再免疫1次,。待最后一次免疫后的7～10天，取靜脈血測(cè)試抗體效價(jià)(試血),，效價(jià)達(dá)到要求后即可一次性放血,，采用頸動(dòng)脈放血，得抗血清,。筆者采用此法先后免疫成功ApoAⅠ,、AⅡ、B100和E的抗血清,。

　　(3)抗血清的保存

　　免疫成功的動(dòng)物放血過(guò)程,，所有用具均嚴(yán)格消毒，并按無(wú)菌操作方式進(jìn)行放血,?？寡宓姆栏瘎┮?.05%疊氮鈉為宜;也可采用加入20%～30%無(wú)菌甘油保存的方法,。若時(shí)間較長(zhǎng)，不用可采用-20℃低溫保存,。一般在0～8℃保存1年,，抗體效價(jià)幾乎無(wú)改變，保存2年,，其效價(jià)稍有降低,。抗體切忌反復(fù)凍融,，否則抗體效價(jià)很快降低,，以頸動(dòng)脈一次性放血為宜。

　　2.單克降抗體的制備

　　單克隆抗體是一種高度特異性的抗體,。單克隆抗體與多克隆抗體有一定的差別,。抗體含量比較,，單克隆抗體濃度高,，腹水中可達(dá)0.5～10mg/ml，而多克隆僅0.1～1.0mg/ml;結(jié)合特性,，單克隆抗體僅與單個(gè)抗原決定簇結(jié)合,，特異性和親和力高，多克隆抗體可與所有抗原決定簇結(jié)合,，特異性和親和力比較差;含免疫球蛋白類型,，單克隆抗體僅一種亞類，多克隆抗體為所有種類和亞類,。單克隆抗體在腹水中含量較高,，可以人工培養(yǎng)，專一性強(qiáng)等特性是多克隆抗體無(wú)法比擬的優(yōu)點(diǎn),。

　　(1)單克隆抗體產(chǎn)生機(jī)理

　　單克隆抗體制備過(guò)程中需要兩種細(xì)胞和即骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞,。骨髓瘤細(xì)胞是一種惡變細(xì)胞，在體外有無(wú)限的增殖能力,，并能分泌很多化學(xué)結(jié)構(gòu)均一的免疫球蛋白,，但特異性很差，當(dāng)它與不同性質(zhì)的動(dòng)物脾細(xì)胞融合時(shí),，可形成雜交瘤細(xì)胞株,。該細(xì)胞株在HAT培養(yǎng)基(內(nèi)含次黃嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶)中生長(zhǎng)良好,，而骨髓瘤細(xì)胞則在HAT培養(yǎng)基中不能生長(zhǎng),。因?yàn)棰偃狈Υ吸S嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用次黃嘌呤合成嘌呤;②氨基喋呤可阻止細(xì)胞內(nèi)嘌噙和胸腺嘧啶的合成,。經(jīng)免疫的動(dòng)力脾細(xì)胞,，不能在體外增殖,，但是能產(chǎn)生相應(yīng)的特異抗體，可以與骨髓瘤細(xì)胞融合,，并形成可分泌單克隆抗體的細(xì)胞株,。

　　操作過(guò)程，一般是先把骨髓瘤細(xì)胞和經(jīng)免疫的脾細(xì)胞置在聚乙二醇(PEG)中進(jìn)行融合,，然后在HAT培養(yǎng)液中選擇培養(yǎng),，由此得到雜交瘤細(xì)胞，采用有限稀釋法,，即能把產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株篩選出來(lái),。該細(xì)胞再經(jīng)人工培養(yǎng)，或注射到小鼠體內(nèi)等亞克隆方法,，即可得到單克隆抗體,。

　　(2)操作：以ApoAⅠ為例。①免疫小鼠：取ApoAⅠ500μg注射入小鼠腹腔內(nèi),，抗原以1：1的比例溶于完全福氏佐劑中乳化,。每2～3周追加一次1：1不完全福氏佐劑抗原混合物，共3次,。一般1次接種5～10只小鼠,。從每只小鼠尾靜脈或眼眶取血，采用ELISA方法或單向免疫擴(kuò)散法鑒定抗體效價(jià),，用作鑒定的鼠血清至少按1：2000稀釋,。在取出小鼠脾臟之前3天應(yīng)該再靜脈注射一次抗原以提高其效價(jià);②培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞：取HGPRT-骨髓瘤細(xì)胞，經(jīng)HAT培養(yǎng)液培養(yǎng),，并取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的細(xì)胞(細(xì)胞死亡數(shù)<5%)供融合使用;③制備脾細(xì)胞：將接種免疫成功的小鼠脾臟取出(無(wú)菌操作),，放入裝有5ml冷水的不含血清DMEM(高葡萄糖)液中，勻漿,，直至成為單細(xì)胞懸液(約108細(xì)胞)，將脾細(xì)胞移入到一個(gè)50ml有蓋管內(nèi),，冰水中靜置5分鐘,，待碎片沉淀后，將上清液移出,。離心,，NH4Cl緩沖液溶解脾細(xì)胞中的紅細(xì)胞，得到脾細(xì)胞懸液(無(wú)紅細(xì)胞);④細(xì)胞融合(雜交)增殖：取瘤細(xì)胞(107)與脾細(xì)胞(6×107)混合,，再洗1次,，制備雙份，分別用40%PEG1000(pH8.0)進(jìn)行融合,，離心沉淀,，于沉淀細(xì)胞中加RPM1-1604完全培養(yǎng)液稀釋,。取此稀釋液0.5ml分別加到含腹腔細(xì)胞(HGPRT-小鼠)的24孔板的每一孔穴中，置于37℃溫箱中,，次日吸出0.5ml上清液,，加入HAT溶液0.5ml。如此連續(xù)操作兩天,，以后每隔2～3天重復(fù)1次,，半月后改換HT培養(yǎng)液，再過(guò)半月后,，改用RPM1-1604完全培養(yǎng)液,，均處于37℃環(huán)境;⑤單克隆抗體細(xì)胞株篩選;當(dāng)雜交瘤細(xì)胞長(zhǎng)滿孔穴的1/3時(shí)，即可對(duì)培養(yǎng)液中的抗體檢測(cè),，連續(xù)2次呈陽(yáng)性孔穴,，要立即克隆到預(yù)先加腹腔細(xì)胞(104/孔)的96孔板中，每孔含有一個(gè)雜交瘤細(xì)胞,，一般經(jīng)3～4天后克隆細(xì)胞開始增殖,。接著再挑出陽(yáng)性孔穴進(jìn)行克隆，這樣得到的上清液即為單克隆抗體;⑥雜交瘤細(xì)胞腹水單克隆抗體的制備：取0.5ml Pristane(2,，6,，10，14-四甲基十五烷)液注射入HGPRT-小鼠腹腔內(nèi),，7～15天后,，取0.5×106～1.0×106雜交瘤細(xì)胞以同一途徑進(jìn)行注射，15～30天后可以收集腹水5～10ml,，抗體效價(jià)顯著增高;單克隆抗體制備過(guò)程如圖18-1所示;⑦細(xì)胞株的保存：于保存管中加入0.5～1.0ml保存液(含10%二甲基亞砜的小牛血清液)106雜交瘤細(xì)胞株,，置聚乙烯塑料盒。-40～-80℃過(guò)夜,，爾后移至液氮罐保存,。

　　圖 18-1 單克隆抗體的制備(源自：Goding JW.1987)

　　(3)抗體的檢測(cè)

　　抗體檢測(cè)可分別采用免疫火箭電泳法、單向擴(kuò)散法,、免疫電泳法,、ELISA法、免疫透射比濁法和放射免疫沉淀法,。