一,、原理

　　將抗載脂蛋白血清均勻地混合于瓊脂糖凝膠內(nèi)，打孔,，加樣,?？字写郎y(cè)樣品的抗原輻射狀向含抗體的膠內(nèi)擴(kuò)散，至抗原與抗體的量達(dá)一定比例時(shí)形成可見的沉淀環(huán),。一定條件下沉淀環(huán)的直徑或面積與相應(yīng)的抗原Apo含量成正比,。

　　二、試劑

　　1.0.05mol/L pH8.2巴比妥鈉-HCl緩沖液;巴比妥鈉15.8g加水至1000ml,。以1.17mol/l HCl調(diào)pH至8.2,，約1.17mol/L Hcl(濃HCl 19.3ml加水180.7ml)18.36ml，最后以蒸餾水補(bǔ)足至1421.8ml,。

　　2.24.0g/L瓊脂糖：優(yōu)質(zhì)瓊脂糖粉2.4g,，硫柳汞0.01g，加0.05mol/lpH8.2巴比妥鈉HCl緩沖液100ml,，加熱融化后,，根據(jù)澆注板的大小分裝,，每管5.8ml,、3.4ml、1.5ml,，加塞后4℃或室溫保存,。

　　3.0.1g/L硫柳汞生理鹽水：1000ml生理鹽水中含硫柳汞0.1g。

　　4.抗血清：臨用前根據(jù)澆注板的大小,，按效價(jià)稀釋,。

　　三、操作

　　1.澆注瓊脂糖凝膠板

　　取“凹”型有機(jī)玻璃框架,，厚1.6mm,，兩邊夾6×12cm玻璃，再用鐵夾夾緊玻璃待用,。

　　加熱融化24.0g/L瓊脂糖,，56℃水浴保溫。根據(jù)抗Apo血清效價(jià),，按表18-19進(jìn)行配制,。

　　表18-19 含抗血清瓊脂糖板配制法

　　試　 劑抗　血　清　RID　法 效　價(jià)

　　202530406080

　　24.0g/L瓊脂(ml)5.805.805.805.805.805.80

　　硫柳汞鹽水(ml)5.225.345.415.515.615.65

　　抗血清(ml)0.580.460.390.290.190.15

　　將稀釋的抗血清傾入已融化的瓊脂糖中，顛倒混勻1～2次,，避免產(chǎn)生氣泡,，迅速澆注預(yù)置水平位置的雙層玻板內(nèi)，待凝,?？寡逍r(jià)高時(shí)，亦可直接將抗血清混入12.0g/L瓊脂中,，搖勻后制板,。

　　2.按模式圖用直徑3mm的金屬管打孔,，6×12cm免疫擴(kuò)散板打孔28個(gè)，6×8cm免疫擴(kuò)散板打孔16個(gè),。

　　3.待測(cè)血清用硫柳汞鹽水稀釋(按說(shuō)明書),，用微量加樣器每份標(biāo)本加1孔。加樣量10μl,。置濕盒(水平位置)37℃擴(kuò)散24h,，測(cè)沉淀環(huán)直徑，如圖18-2所示,。

　　圖18-2　單向免疫擴(kuò)散圖(0.8%瓊脂糖)

　　4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備(參考方法)

　　(1)參考血清稀釋法：取Apo含量標(biāo)準(zhǔn)參考血清用鹽水稀釋成梯度濃度,。ApoAⅠ：20、40,、60,、80、100mg/dl,，同上法操作加樣,，每一稀釋濃度應(yīng)在兩塊板的不同位置各加樣孔，每孔5μl,。37℃濕盒擴(kuò)散24h,，測(cè)沉淀環(huán)直徑，求出各稀釋度均值,。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,。

　　(2)用半對(duì)數(shù)紙制作：以抗原含量為縱坐標(biāo)(對(duì)數(shù))，沉淀環(huán)直徑為橫坐標(biāo),，在半對(duì)數(shù)紙上作圖,。一般要求至少有4個(gè)不同稀釋度。增加標(biāo)準(zhǔn)曲線上的點(diǎn)數(shù);可增加其可靠程度,。

　　(3)用推算平均值法制備標(biāo)準(zhǔn)曲線：RID定量法盡管嚴(yán)格遵守所有的試驗(yàn)條件,，但不同濃度所求得的沉淀環(huán)直徑，在繪制曲線時(shí)仍然常不在一條直線上,，推算平均值法是通過(guò)數(shù)學(xué)方法處理,，使不在標(biāo)準(zhǔn)曲線上的各點(diǎn)回歸到同一直線上來(lái)?？捎霉絣og y=ax+b表示,。

　　結(jié)果判斷

　　根據(jù)待測(cè)血清在含抗Apo血清免疫擴(kuò)散板上形成的沉淀環(huán)直徑，查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可行相應(yīng)Apo的含量,?？梢詍g/dl報(bào)告，也可以國(guó)際單位報(bào)告(g/L)