蛋白質(zhì)溶液濃度測定方法有多種，下述幾種方法可供選用,。蛋白質(zhì)濃度的測定,，往往用于計算純化方法的回收率的重要方法,。

　　一、雙縮脲法

　　雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質(zhì)濃度的方法,，至令仍廣泛采用,。在需要快速，但不很準(zhǔn)確的測定中,，常用此法,。硫銨不干擾顯色，這對蛋白質(zhì)提純的早期價段是非常有利的,。雙縮脲法的原理是Cu2+與蛋白質(zhì)的肽鍵,，以及酪氨酸殘基絡(luò)合，形成紫藍(lán)色絡(luò)合物,，此物在540nm波長處有最大吸收,。雙縮脲法常用于0.5g/L～10g/L含量的蛋白質(zhì)溶液測定。干擾物有硫醇,，以及具有肽性質(zhì)緩沖液,，如Tris、Good緩沖液等,?？捎贸恋矸ǔジ蓴_物，即用等體積10%冷的三氯醋酸沉淀蛋白質(zhì),，然后棄去上清液,，再用已知體積的1m NaOH溶解沉淀的蛋白質(zhì)進(jìn)行定量測定。

　　二,、Lowry法

　　此法是雙縮脲法的進(jìn)一步發(fā)展,。他的第一步就是雙縮脲反應(yīng)，即Cu++與蛋白質(zhì)在堿性溶液中形成絡(luò)合物,，然后這個絡(luò)合物還原磷鉬磷-磷鎢酸試劑(福林-酚試劑),，結(jié)果得到深藍(lán)色物。此法比雙縮脲法靈敏得多,，適合于測定20mg/L～400mg/L含量的蛋白質(zhì)溶液,。其干擾物質(zhì)與雙縮脲法相同，而且受他們的影響更大,，硫醇和許多其他物質(zhì)的存在會使結(jié)果嚴(yán)重偏差,。另外要注意的是，加入福林試劑時要特別小心,，試劑只在酸性pH環(huán)境中才穩(wěn)定,，上述提到的還原反應(yīng)只有在pH10時才發(fā)生，因此,，福林試劑加入到堿性的Cu2+-蛋白質(zhì)溶液中時,，必須立刻攪拌,，以使磷鉬酸-磷鎢酸試劑在未被破壞之前能有效地被Cu2+-蛋白質(zhì)絡(luò)合物所還原。

　　三,、紫外吸收法

　　大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長處有特征的最大吸收,，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在的緣故,，因此,，利用這個特異性吸收，可以計算蛋白質(zhì)的含量,。如果沒有干擾物質(zhì)的存在,，在280nm處的吸收可用于測定0.1～0.5mg/ml含量的蛋白質(zhì)溶液。部分純化的蛋白質(zhì)常含有核酸,，核酸在260nm波長處有最大吸收,。有核酸時，所測得的蛋白質(zhì)濃度必須作適當(dāng)校正,，一般按下述公式粗略計算：

　　是蛋白質(zhì)溶液在280nm波長處(光程1厘米)測得的光密度值,。

　　是蛋白質(zhì)溶液在260nm小波長處(光程1厘米)處所測得的光密度值。

　　此方程是從烯醇酶(在酵母核酸存在時)得出來的,。因此,，對其他蛋白質(zhì)和其他核酸不一定適用,。由于各種蛋白質(zhì)所含芳香族氨基酸的量不同,，因此，濃度為0.1%的各種蛋白質(zhì)在280nm處的消光系數(shù)(

　　)在0.5～2.5之間變化,。

　　所有的蛋白質(zhì)在230nm以下都有強(qiáng)吸收,。例如，牛血清白蛋白的α0.1%在225nm和215nm處分別為5.0和11.7,，而在280nm處測為0.58,。在230nm以下的強(qiáng)吸收是由于肽鍵的存在，因此,，此值對所有的蛋白質(zhì)都是一樣的,。從215nm和225nm處的光密度之差可用于測定濃度為10μl/ml～100μl/ml的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)濃度可以近似地由下式得到：

　　光密度之差

　　得,，這一公式是減去溶液中非蛋白質(zhì)成分產(chǎn)生的誤差,。但是，蛋白質(zhì)之間的分子量差異比較大,，因此,，在比較幾種蛋白質(zhì)含量時，必須作適當(dāng)?shù)男Ｕ?。由于蛋白質(zhì)的吸收峰常因pH改變而變化,，所以在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時,，必須與樣品條件一致。

　　(吳翠華　賀小玲　周新)