載脂蛋白分離純化后,，獲得了所需要的純品，該純品純度及其品種可通過下述方法進(jìn)行鑒定,。

　　一,、免疫電泳法

　　免疫電泳法既可用于鑒定蛋白種類,，又可鑒定其純度。

　　制備1%的瓊脂糖,，以0.1mmol/L巴比妥緩沖液(0.05μ,pH8.6)為溶劑,，制作一塊約7×4cm的大小，厚度為0.2～0.3cm的瓊脂糖凝膠,，以玻璃板或薄膜為支持物,，于凝膠正中打孔(直徑0.2cm)。1孔加全血清5μl,，2孔(中間孔)加純化的某產(chǎn)品,，3孔加已知某載脂蛋白。電泳電極液為0.05μ,，pH8.6的巴比妥緩沖液,。當(dāng)標(biāo)本前沿泳動到距離凝膠端1cm左右，停止電泳,，取出凝膠板,，在凝膠板三孔之間開兩條寬0.2cm，長5～5.5cm長的凝膠槽,。1與2孔之間的凝膠槽(A槽)中加入羊抗人全血清抗體,，2與3孔之間的凝膠槽(B槽)加入羊抗人某Apo單價特異抗血清，將凝膠板置于含少量水的大平皿中,，加蓋,，水平置于37℃培養(yǎng)箱24h，再觀察弧形白色沉淀線,，與A槽沉淀線位置比較若位置完全相同,，初步可以確認(rèn)為2孔純化產(chǎn)品與3孔標(biāo)準(zhǔn)蛋白是同一蛋白質(zhì)，如圖17-7所示,。

　　圖17-7 免疫電泳圖(瓊脂糖凝膠)

　　A：1,、2、3分別為抗人ApoAⅠ血清(第一化學(xué)),、抗人全血清,，抗人ApoAⅠ血清(自制);a、b,、c,、d分別為ApoAⅠ純品(純化產(chǎn)品),、人血清,、人血清、ApoAⅠ純品(sigma)

　　B:1,、2分別為抗人全血清,，抗有ApoB血清(自制)：a,、b、c分別為人血清,、人血清和人ApoB純品(自制)

　　二,、免疫火箭電泳

　　按本章節(jié)的方法進(jìn)行操作，若為單一火箭沉淀峰,，也可判純化產(chǎn)品為單一蛋白,，如圖17-8所示。

　　三,、免疫雙擴(kuò)散法

　　制備1%瓊脂糖凝膠(0.05μ,，pH8.6的巴比妥緩沖液為溶劑)，按圖打孔,。圖17-9中孔加入已知某Apo單價特異羊抗人血清,，周邊第1孔加純化產(chǎn)品，第2孔加已知某Apo純品,，置37℃培養(yǎng)箱24h,，若第1與2孔旁兩條白色沉淀線相互融成一個弧形，無分叉,，表明1孔與2孔的蛋白質(zhì)與中孔抗血清的抗有相同的抗原性,，可確認(rèn)為同一蛋白質(zhì)。

　　17-8 免疫火箭電泳圖

　　A：瓊脂糖凝膠板含抗人全血清,、抗原孔含人ApoAⅠ純品;

　　B：瓊脂糖凝膠析含抗人全血清,、抗原孔含人ApoB純品。

　　圖17-9 各種抗原抗體系的沉降線示意圖

　　1,，2：同一抗原抗體系(complete identity)

　　3：不同的抗原抗體系(nonientity)

　　4：部分相同的抗原抗體系(partialidentity)

　　四,、等電聚焦電泳

　　利用IEF-PAGE測等電點，根據(jù)等電點確認(rèn)蛋白質(zhì)性質(zhì),。

　　五,、蛋白質(zhì)分子量測定

　　從化學(xué)觀點考慮，分子量是組成蛋白質(zhì)分子的各原子量總和,。但是,，對大分子的蛋白質(zhì)來講，若不知道分子量也無法得知每個分子的元素組成情況,。為此,，人們在蛋白質(zhì)的研究中，對測定其分子量工作極為重視,，先后用于測定蛋白質(zhì)分子量的方法有滲透壓,、粘度、光散射,、蛋白質(zhì)氨基酸序列分析法,、超速離心(沉降速度或沉降平衡),、凝膠層析和SDS-PAGE等法。載脂蛋白分子量測定多采用超速離心沉降速度法,、凝膠層析法和SDS-PAGE法,。

　　凝膠法層析用：1gM=A-B(Ve/Vo)

　　SDS-PAGE用：lgM=A-BRf

　　式中，對已知標(biāo)準(zhǔn)樣品,，x和y分別為實驗值和已知值,。n是實驗的點數(shù)。采用上述兩個方程,，由已知樣品的數(shù)據(jù),，可以求出標(biāo)準(zhǔn)線的兩個常數(shù)A、B值,。對未知樣品,，只要測出x，利用A,、B值可以計算出y值,。總之,，從實驗測得的數(shù)據(jù)計算該實驗方法所用方程的常數(shù),，再用這個常數(shù)計算出未知樣品的分子量，所得結(jié)果比作圖法精確,，且很方便,。

　　下文僅介紹SDS-PAGE作圖法測定蛋白質(zhì)的分子量。

　　十二烷基磺酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)是一種陰離子去污劑,，于100℃加熱,，在β-巰基乙醇存在下，可以使大多數(shù)多聚體蛋白質(zhì)的四級結(jié)構(gòu)解體,，并與各亞基牢固地結(jié)合,，從而遮蔽了蛋白質(zhì)分子上原有電荷，同時帶上強的負(fù)電荷,。

　　由于所有的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物(圖17-10),，在電泳時都以同樣的電荷按分子量大小不同向正極移動，作SDS聚丙烯酰胺凝膠泳動(SDS-PAGE)時,，其泳動速度僅決定于蛋白質(zhì)的分子量,。SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是成比例的，所以SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物在泳動中的不同速率,，就反映了分子量的不同,。與分子量的對數(shù)和相對遷移率成一定比例關(guān)系。使用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)物作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖17-11,，圖17-12)或用計算法確定標(biāo)準(zhǔn)曲線的常數(shù),，即可求出未知樣品的分子量,。用這種方法測定的分子量是亞單位肽鏈的分子量,。

　　圖17-10 SDS對蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)的破壞作用,，SDS與亞基牢固地結(jié)合，遮蔽了蛋白分子的原有電荷

　　實驗結(jié)果也可以通過公式運算求蛋白質(zhì)分子量：

　　先求得遷移率Rf,，Rf=de/do

　　de為樣品遷移距離,，do為前沿遷移距離(染料)

　　從幾種標(biāo)準(zhǔn)樣品的Rf值和分子量對數(shù)，用最小二乘法能準(zhǔn)確地求得a,、b二常數(shù),，從而可進(jìn)行未知物分子量的計算。

　　圖17-11 人ApoAⅠ分子量測定圖(SDS-PAGE)

　　圖17-12標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)分子量測曲線(SDS-PAGE)

　　1為蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量(LKB)：

　　2為ApoAⅠ純品(Sigma);

　　3為ApoAⅠ純品(自制)

　　SDS-PAGE的分子量測定簡要步驟是：①制備4%～30%的聚丙烯酰胺梯度凝膠;②待測蛋白純品和標(biāo)準(zhǔn)分子量標(biāo)本的制備,，按蛋白樣品1mg/ml濃度溶于含有20%蔗糖的電極緩沖液中,，加入5μl0.1%溴酚蘭作指示染料，取50μl上樣;③電泳：電極緩沖液(有多種),，含1%SDS;④染色脫色：考馬斯亮蘭R-250染色,，脫色;⑤制作標(biāo)準(zhǔn)分子量曲線;量取從原點到前沿溴酚蘭及原點至各條蛋白區(qū)域的距離。計算各自標(biāo)準(zhǔn)蛋白的Rf值,，以LogMW對相應(yīng)的Rf作圖,，繪成標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白曲線如圖17-8、圖17-9所示,，以待測蛋白質(zhì)的Rf值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上得到LgMW值,，計算待測Apo純品的分子量。

　　測定分子量的SDS-PAGE法主要優(yōu)點是快速,，樣品用量少,，可同時測定幾個樣品。缺點是誤差較大,，誤差主要與電泳蛋白區(qū)域移動距離測量是否有關(guān),。

　　SDS-PAGE法測定的是亞單位肽鏈的分子量。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)如表17-1所示,。

　　表17-1 標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)及其分子量

　　名　 稱分 子 量名　 稱分 子 量

　　細(xì)胞色素C11700過氧化氫酶(單體)60000

　　核糖核酸酶13700牛血清白蛋白(單體)68000

　　肌紅蛋白17200乳酸脫氫酶(單體)36000

　　胰凝乳蛋白酶原25700乳酸脫氫酶130000

　　胰蛋白酶23300β-淀粉酶215000

　　羧肽酶A34600過氧化氫酶240000

　　胃蛋白酶35000黃嘌呤氧化酶275000

　　卵清白蛋白45000脲酶483000

　　六,、雙相電泳

　　血漿或組織中有成千累萬種蛋白質(zhì)，等電點近似,，分子量大小類同的蛋白質(zhì)很多,，若僅單一測蛋白質(zhì)的pI或分子量，還不足以說明是某一的蛋白質(zhì),，可能是也可能不是,。如果既測定pI，又測定分子量,，利用這兩種參數(shù)鑒定蛋白,，其確認(rèn)的準(zhǔn)確率將得到很大的提高,，因為這兩種參數(shù)都相同的蛋白質(zhì)的概率是很小的。為此常采用雙相電泳技術(shù)即第一相為IEF-PAGE,，另一相為SDS-PAEG,，進(jìn)行蛋白質(zhì)的鑒定。

　　七,、蛋白質(zhì)化學(xué)組成分析

　　末端氨基的分析,，是鑒定蛋白質(zhì)純度的方法之一。一條肽鏈的蛋白質(zhì),，通過N-末端的定量分析,，每克分子蛋白質(zhì)應(yīng)當(dāng)有整數(shù)克分子的N-末端氨基酸，少量其他末端氨基酸的存在,，常常表示存在有雜質(zhì),。

　　分析蛋白質(zhì)各種氨基酸百分比，也可作為蛋白質(zhì)各類鑒定的參考值,。

　　最終的純度標(biāo)準(zhǔn),，應(yīng)當(dāng)是氨基酸順序的測定。