一,、血清脂蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳

　　(一)原理

　　以聚丙烯酰胺為支持介質(zhì),，血清脂質(zhì)用染料預(yù)染，使脂蛋白著色,，經(jīng)電泳后,，一般可分出三條區(qū)帶，即β-,、前β-,、α-脂蛋白。并可用光密度掃描儀檢測其相對百分數(shù),，乘以總脂量,，可求出三種脂蛋白的含量。

　　(二)試劑與儀器

　　1.試劑

　　(1)分離膠緩沖液：三羥甲基氨基甲烷(Tris)18.3g,lmol/L鹽酸24ml,，加水至100ml(pH8.9),。

　　(2)丙烯酰胺Ⅰ液：丙烯酰胺(Acr)15g，甲叉雙丙烯酰胺(Bis)0.4g,，混勻,。

　　(3)0.35%過硫酸銨(AP)

　　(4)四甲基乙二胺(TEMED)

　　(5)丙烯酰胺Ⅱ液：Acr10g、Bis2.5g,、加水至100ml,，混勻。

　　(6)濃縮膠緩沖液：Tris 6g,、1mol/L HCl,。

　　(7)0.002%核黃素，48ml,，加水至100ml,，pH6.7。

　　(8)電極緩沖液：甘氨酸2.88g,、Tris0.6g,、加水至1000ml，pH8.3,。

　　(9)1%蘇丹黑B染色液：蘇丹黑B200mg,，丙二醇20ml，水浴加溫至溶,，離心,，去除沉渣，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　(10)40%蔗糖水溶液,。

　　2.儀器

　　電泳儀,、光密度掃描儀

　　(三)操作

　　1.制膠

　　(1)先準備清潔的0.5×7.5cm玻璃管，封口底,。

　　(2)配制5%濃度凝膠：取丙烯酰胺Ⅰ液5ml,，分離膠緩沖液5ml及Ap液10ml混合，再加TEMED,，20μl,，混均，用吸管注入每支玻璃管內(nèi)使膠柱長約4cm,，上層用蒸餾水沿管壁仔細加水到凝膠表面,，千萬別沖散凝膠界面，使凝膠與空氣隔絕,。靜置20～40min,，等凝膠凝固后，除去上層水,，再加上濃縮膠,。

　　(3)濃縮膠制備：取丙烯酰胺Ⅱ液1.0ml、濃縮膠緩沖液0.5ml,、核黃素液0.5ml和水2ml混勻,，加TEMED20μl混勻，迅速加入到分離膠上層約1cm高度,，沿管壁仔細加蒸餾水覆蓋,，千萬別沖散凝膠界面,。置日光燈處聚合30min，也可在強光下聚合,，聚合好的濃縮膠呈淡乳白色,。凝膠可置4℃冰箱備用。

　　2.血清預(yù)染與加樣

　　在0.25ml血清中加入1%蘇丹黑B染色液0.025ml,，搖勻,，于37℃水溶保溫45min。離心除去沉渣,，取預(yù)染血清30μl,，加在聚合好的傾去水層的濃縮膠表面，再加一滴40%蔗糖液,，混勻,，然后小心地在上面加滿電極緩沖液，再裝在電泳槽上,。

　　3.電泳

　　將電極液加入上下電泳槽內(nèi),，靠樣品端的上槽接負極，下槽為正極,，接通電源,，調(diào)節(jié)電流為2-5mA/管，30～40min后,，關(guān)閉電源,。

　　4.剝膠

　　從電泳槽上取下凝膠管，用帶長針頭的注射器吸水注入凝膠與玻管內(nèi)壁之間,，使凝膠與玻管內(nèi)壁分離,，再用吸耳球推出凝膠。根據(jù)不同型號的光密掃描儀,，凝膠掃描或者將裝有凝膠的玻管直接掃描定量,。

　　電泳后凝膠一般出現(xiàn)三條區(qū)帶，從正極到負極依次為α-脂蛋白,，β-脂蛋白和前β-脂蛋白,，前β-脂蛋白處于濃縮膠和分離膠之間。

　　5.定量

　　漿凝膠或連同玻管一道置于光密度計掃描儀上進行掃描,，計算每個峰的面積占各峰之和和總面積之比,，即為每種脂蛋白組份的百分比。

　　二,、血清脂蛋白瓊脂糖電泳法

　　(一)原理

　　以瓊脂糖凝膠為支持介質(zhì),，先用脂類染料將血清進行預(yù)染，使血清脂蛋白著色，然后電泳,。切下各脂蛋白區(qū)帶,，加熱溶解，冷卻后比色,?；蛘哂霉饷芏扔嬛苯訏呙鑳x定各區(qū)帶。計算出α,、β-和前β-脂蛋白的相對百分比。

　　(二)試劑

　　1.巴比妥HCl緩沖液(pH8.6,，離子強度0.075)：稱取巴比妥鈉15.5g,，加入1mol/LHCl12ml，混勻溶解,，加蒸餾水至1000ml,，此為電極緩沖液。

　　2.巴比妥-HCl緩沖液(pH8.6,離子強度0.05)：稱取巴比妥鈉10.3g,加入1mol/LHCI8ml,，混勻溶解,，加蒸餾水至1000ml，用于配瓊脂糖凝膠用,。

　　3.0.8%瓊脂糖凝膠：取瓊脂糖0.8g,，溶于配瓊脂糖凝膠的緩沖液100ml，置沸水煮溶或置于微波爐中熱溶解,。

　　4.1%蘇丹黑B的石油醚-乙醇(1：4,，V/V)溶液。

　　(三)操作

　　1.預(yù)染血清：吸血清0.2ml于一小試管中,，再加蘇丹黑B染色液0.02ml及無水乙醇0.01ml,。混勻后置于37℃水溶預(yù)染20min,。取出各管,，2000r/min離心5min，以除去多余的染料,。

　　2.瓊脂糖凝膠板制備：將0.8%瓊脂糖凝膠溶解后,，吸2.5ml到載玻片上，趁熱將刻點樣槽用有機玻璃蓋放在距載玻片一側(cè)近1cm處,。一塊載玻片前后可打兩個槽點兩份樣品,。

　　3.點樣與電泳：取下凝膠上有機玻璃蓋并顯出一加樣小槽。取預(yù)染血清40μl,，注入此小槽中,。在電泳槽內(nèi)加入巴比妥電極緩沖液，樣品端為負極,。以四層濾紙或沙布搭橋按10V/cm電泳,，待預(yù)染血清電泳至最高或40min,，切斷電源。

　　4.定量：

　　(1)切割比色法：將凝膠板上各脂蛋色帶分別切開置于裝入有3ml蒸餾水的試管內(nèi),。切相應(yīng)大小的空白瓊脂糖放入3ml蒸餾水試管內(nèi),，為空白管，各管放入沸水煮3min,，瓊脂糖溶解,，待冷，以空白管調(diào)零點,，于660nm處比色,，記錄吸光度，以α-,、前β-和β-脂蛋白三條區(qū)帶吸光度總和,，比各自區(qū)帶的吸光度，求其百分比,。這種半定量方法不夠準確,，誤差很大。

　　(2)掃描定量：預(yù)染脂蛋白瓊脂糖凝膠電泳畢,，其瓊脂糖凝膠板上有色帶,，可直接置于光密度掃描儀掃描，并得出各區(qū)帶的百分比,，如果輸入該病人的血脂總量,，即可算出α-、前β-和β-脂蛋白的各自含量,，如圖16-2所示,。

　　圖16-2 血清脂蛋白電泳(瓊脂糖)

　　正常參考值(百分比)：

　　α-脂蛋白 25.7±4.1%

　　前β-脂蛋白 21.0±4.4%

　　β-脂蛋白 53.3±5.3%

　　注意事項：①血清樣品要新鮮;②為了免去離心步驟，吸取預(yù)染血清時,，應(yīng)吸取上層,，下層或管底可能有染料顆粒沉渣，否則應(yīng)再離心后吸預(yù)染血清,。