一,、超速離心法簡介

　　為了研究,，常需要得到脂蛋白純品并進(jìn)一步分離純化載脂蛋白，迄至目前為止,，采用密度梯度超速離心分離純化各種脂蛋白仍是一種很好的方法,。

　　超速離心法可分為制備型和分析型兩種，根據(jù)其所用介質(zhì)密度不同,，可以分為等密度離心,，密度梯度離心等,。根據(jù)所用轉(zhuǎn)頭的類型不同可以分為角頭,、甩平頭、垂直頭和區(qū)帶頭離心法。脂蛋白分離中,，采用密度梯度超速離心法較多,。

　　離心作用是根據(jù)穩(wěn)定角速度下做圓周運(yùn)動的任何物質(zhì)都受到一個外向的離心力F，這種力的大小取決于角速度(以弧度ω表示)和旋轉(zhuǎn)半徑r(以cm計算),。

　　F=ω2r

　　F常用地球引力表示,，稱為相對離心力(RCF)或者常用“數(shù)字×g”來表示。

　　RCF=ω2r/980

　　在使用該公式時,，這些關(guān)系需用“每min轉(zhuǎn)數(shù)(r/min)”表示,，這是表示離心機(jī)轉(zhuǎn)動速度的普通方式。

　　由于(r/min)的數(shù)值可轉(zhuǎn)換成弧度,，利用ω=π(r/min)/30公式代入上式,，得到下述換算式：

　　RCF-(πr/min)2×r/302/980=(1.119×10-5)(r/min)2·r

　　對于在離心轉(zhuǎn)頭中旋轉(zhuǎn)的樣品，估計其所受到的相對離心力需要考慮樣品到旋轉(zhuǎn)中心的固定距離(r),。由于轉(zhuǎn)頭的形狀設(shè)計,，離心管中從管頂主管底各點(diǎn)旋轉(zhuǎn)中心的距離是不同的。例如在固定的角式轉(zhuǎn)頭中,，作用于離心管頂部和底部的離心力的差別接近一倍,。為了計算相對離心力的數(shù)值可用平均相對離心力(RCF平均)來表示，即同一離心轉(zhuǎn)頭頂部和底部所受離心力的平均值,。因此,，最重要的將是確定半徑(r)的數(shù)值。

　　形成密度梯度操作,，可采用兩種方法,，一是利用自動形成器，此裝置是在一根管道上裝有兩個容器,，各以T型管與此管道相通,，兩容器分別裝入輕液和重液，按比例進(jìn)入混合器,，并用蠕動泵將溶液注入超離心管內(nèi),，形成不同密度液，加入到超離心管中,，使其離心管中液體成密度梯度離心分布,。二是采用手工操作，先配成不同密度溶液,，人工一層層鋪蓋到超離心管內(nèi),，使超離心管中成為不同密度梯度的溶夜。

　　超速離心后樣品的收集可根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)條件采用下述幾種方法,。

　　(1)切割法：在固定的刀架上,，將已離心好的樣品管放在所要求的高度(按管內(nèi)分離區(qū)帶確定)用刀切斷離心管,，取出樣品。

　　(2)虹吸法：用蠕動泵或吸管將樣品從上至下逐層按區(qū)帶吸出并分管收集,。泵管或吸管注意每區(qū)帶一管,，不能混用。

　　(3)穿剌法：用針頭在超速離心管底部穿一小孔,，讓液體從底部流出,，并按區(qū)帶分部收集。

　　分管收集到的各區(qū)帶樣品,，可采用折光儀,，測出折光系數(shù)，從表中查出相應(yīng)溶液的水合密度,，從而確認(rèn)各組份的分布樣品的水合密度,。

　　二、Hatch-Lee法(同時分離血漿脂蛋白方法)

　　1.試劑

　　0.5mol/LEDTA(pH8.0):186g EDTA-Na2加入去離水950ml,，用NaOH調(diào)準(zhǔn)pH值,，再加水到1L。

　　溶液①(d=1.006):NaCl 11.40g,0.5ml0.5mol/L EDTA液,，加去離子水1l,，EDTA可抑制脂蛋白中脂質(zhì)的氧化。

　　溶液②(d=1.182):NaBr24.98g溶于溶液①100ml中,。

　　溶液③(d=1.478):NaBr78.32溶于溶液②100ml中,。

　　0.15mol/LNaCl,0.3mlEDTA:8.77g NaCl、0.6ml的0.5mol/l EDTA(pH8.0),，再加雙蒸水到1L,。

　　d=1.019液：1.851gKBr溶于溶液①100ml中。

　　d=1.063液：8.343gKBr溶于溶液①100ml中,。

　　d=1.215液：33.496gKBr溶于溶液①100ml中,。

　　以上溶液的密度，必要時用折射儀檢測,。

　　2.操作

　　取10mlEDTA Na2抗凝(1mg/ml)采血,，離心(3000r/min)10min，分離得血漿,。取血漿4ml加入容量10ml的超離心管中的底層,，上面鋪蓋2ml溶液①(d=1.006)液，20kr/min(26kXg)離心30min(4℃),，不用制動器讓其旋轉(zhuǎn)減速,，以防飄浮物與下浮層相混;取出下層4ml混合血漿待用;超離心管中殘留2ml，再取溶液①2ml沿管壁加入,，仔細(xì)混勻分散脂蛋白,，又加溶液①2ml鋪在表面,，20kr/min，4℃,，離心1h，取出上層液直至變界處,，此即CM組份,。再將第一次離心所得的下層4ml混合血漿取出，其上鋪2ml溶液①,，40kr/min(100k×g),，18℃離心17h，取上層1ml液,，此即VLDL組份,。再取出1ml至交界處，棄去,，將管內(nèi)剩余的4ml混合液移入另一超離心管內(nèi),，取2ml溶液②(d=1.182)洗出離心管中殘余的脂蛋白，加入到裝4ml混合液超離心管內(nèi),，混勻,，40kr/min，18℃,，離心21h,，取出上層(d=1.062)1ml混合液，此即LDL組份,。繼續(xù)將中間層1ml除去,，殘存的4ml轉(zhuǎn)入到另一超離心管內(nèi)，用d=1.478(溶液③)2ml洗滌原管,，爾后移入4ml殘存液管內(nèi),，仔細(xì)混勻，40kr/min,，18℃,，離心41h，上層(d=1.20)部分吸出,，即HDL組份,。下層為VHDL(very high density Lipoprotein)與其他血漿脂蛋白。LDL與HDL分別對0.15mol/lNaCl-0.3mmol/L EDTA(pH8.0)透析,，4℃保存,。

　　三、從血漿直接分離LDL

　　用EDTA抗凝血,，離心得血漿,，可采用大容量(300ml)超離管進(jìn)行,。血漿容量依次要加定量的KBr(Xg)，可按下述公式計算：

　　V為血漿容量(ml)數(shù),，d1,、d2分別為該配制的最初的兩種溶液密度，υ為調(diào)節(jié)密度用的KBr的目的試劑水密度的偏比容,。血漿d=1.006,。首先調(diào)節(jié)溶液密度到d2=1.019，離心除去,。VLDL,，d2=1.019的υ為0.2922，即1ml血漿中應(yīng)當(dāng)加KBr0.01851g,，溶解后,，每管注入約16ml將d=1.019溶液8ml(0.5體積)覆蓋其上，40kr/min,，18℃,，離心16h，再除去黃色層以上的上層界面液,，測量下層黃色層液ml數(shù),，再按上式計算添加0.0644g/mlKBr，以成d=1.063的溶液(υ=0.2982)同樣每管(16ml)加8ml的d=1.063溶液覆蓋其上,，40kr/min,，18℃，離心16h,，取上層黃色區(qū)帶,，并對0.15mol/lNaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0)充分透析，該黃色脂蛋白即LDL,，可用作LDL受體的配體,。

　　添加KBr量計算式中的偏比溶(υ)，d=1.019,、1.063,、1.125、1.210,、1.215的值相應(yīng)為0.2922,、0.2982、0.3035,、0.3090,、0.3093。

　　四,、硫酸右旋糖苷(DS)沉淀血清脂蛋白法

　　1.試劑

　　1%DS,、10%DS,、2mol/L CaCl2、1mol/L K2C2O4,、12%NaCl,、0.2mol/l Tris-HCl、0.9%NaCl,、0.01mol/L EDTA(pH7.4)

　　2.操作

　　混合血清在3000r/min下,，離心30min，除去血細(xì)胞及其他固體物質(zhì),，再以2000r/min離心30min(4℃)，以除去血清中的CM,。

　　取一定體積的上述血清,，加1%DS，使血清中的DS濃度為0.05%,，加2mol/lCaCl2,，使血清中CaCl2的終濃度為0.1mol/L，攪拌后放4℃冰箱過夜,，于第二天離心(3750r/min)30min,，將離心后的沉淀物溶解在12%NaCl中，而后加0.2mol/l Tris-HCl緩沖液250ml(pH7.4),，離心10min,棄去上清,，將所得沉淀用0.02mol/l Tris-HCl再洗一次，此步驟要重復(fù)3次,。將最后得到的VLDL和LDL溶解在7.5～15ml的1mol/L草酸鉀中(4℃),，3750r/min離心30分鐘，去掉沉淀,，然后將此溶液在1%NaCl,，1%BaCl2溶液中透析48h(4℃)。將透析過的溶液放于離心管中去掉沉淀,。把上清液再放入0.02mol/l Tris-HCl緩沖液透析72h,，離心，其上清則含有較純的VLDL和LDL

　　五,、無脂蛋白血清的制備

　　1.用途：無脂蛋白血清(lipoprotein deficient serum,LPDS)主要用于LDL受體活性測定的細(xì)胞培養(yǎng),。

　　2.操作：常規(guī)采血，室溫放置1～2h,，以3kr/min離心10min,，分離得到血清。向血清中按每1ml加0.33496g KBr,，使其血清密度為d=1.215,，或者按等體積加d=1.215的KBr液,，按前述兩方法鋪在血清上面，按40kr/min(100k×g)速度,，離心40h,。離心完畢，將淡黃色上層脂蛋白與無色的中間層除去,，下層液上再鋪d=1.215溶液,，重復(fù)上述離心操作。將下層液,，對0.15mol/l NaCl,0.3mmol/L EDTA(pH8.0) 溶液透析,，用過濾器除菌，爾后分成小包裝貯存在-20℃?zhèn)溆谩?/p>

　　六,、其他方法

　　除上述介紹的常用方法外,，還有凝膠過濾和高壓液相層析法分離血漿脂蛋白的方法，有關(guān)參考書很多,，在此不一一介紹,。